Мастер класс из бисера дерево инь янь: Инь-янь из бисера дерево в двух цветах мастер-класс (фото)

by alexxlab Posted in Мастер класс on 24.08.197524.08.2021

Содержание

пошаговое описание, схемы и рекомендации

Украшения для интерьера, сделанные своими руками, не только оживляют обстановку, но и добавляют индивидуальности дизайну. Дерево инь-янь из бисера – яркий элемент, который впишется в любой интерьер. Такое изделие можно купить в магазине товаров ручной работы или попробовать сделать самостоятельно. Это дело потребует терпения и умения, но результат того стоит. Несколько вечеров и эксклюзивное изделие готово.

Символизм

В китайской философии Инь и Ян – это две противоположности, которые являются частями одного целого. Баланс и гармония в мире зависят от единства этих двух половин. Так и дерево инь-янь из бисера привнесет в дом мир и радость. Но и без глубокого смысла это изделие будет радовать глаз и заряжать позитивом.

Материалы для работы

Чтобы сделать дерево инь-янь из бисера своими руками нужно подготовить необходимые для работы материалы и инструменты:

Понадобится бисер двух цветов – черного и белого. Каждого цвета нужно по 200 г, хотя количество зависит от желаемой пышности кроны будущего деревца.
Проволока тонкая медная для создания веточек.
Проволока толщиной 3,5 мм для ствола – около 1 метра. Лучше всего для такого изделия подходит медная проволока — она хорошо держит форму и достаточно прочна, чтобы выдержать вес бисерной кроны.
Нитки белые и черные для обматывания веток и ствола. Лучший вариант – шелковые. Они имеют красивый блеск, что придаст изделию дополнительное очарование и загадочность.

Также понадобятся для оформления:

горшок для дерева;
гипс;
вода;
емкость для смешивания раствора;
ножницы;
кусачки;
краски;
кисточки.

Листья и веточки

Начинать работу нужно с формирования веточек. Для этого на отрезок проволоки длиной 0,5 м нанизать 8 бисерин черного цвета. Отступить от края проволоки не меньше 5 см, сделать петлю, прокрутив проволоку у основания петли пару раз. Так получается листочек. Через сантиметр сделать еще одну петельку, и так до конца проволоки. В конце тоже должен остаться конец не меньше 5 см. Количество листочков должно быть нечетным. Заготовка готова. На фото показана схема дерева инь-янь из бисера.

Теперь нужно сформировать веточку. Для этого необходимо найти центральную петельку и сложить заготовку пополам. Скручивая в одном направлении, следует сформировать веточку, чтобы петельки находились друг напротив друга. Расправить «листочки» и прокрутить оставшиеся свободные концы. Веточка готова. Их понадобится по 70-100 штук каждого цвета.

Ветки и крона

Взять одну веточку черного цвета, приложить к ней другую там, где заканчиваются листочки, и скрутить проволоку. Приложить третью веточку и повторить скручивание. Так получается маленькая ветка. Таким образом нужно соединить по три штуки оставшиеся веточки. Маленькие ветки таким же способом соединяют по три в крупную ветку. Из крупных формируется крона дерева. В конце должны получиться две кроны: черная и белая.

Ветки нужно обмотать нитками в тон бисера. Чтобы нитки оставались на месте их можно фиксировать клеем.

Ствол

Взять кусок толстой проволоки около 50 см и прикрепить к нему заготовленную крону черного цвета. Примотать при помощи тонкой проволоки и зафиксировать черными нитками. То же самое сделать и с белой половиной. Чтобы ствол получился более утолщенным, его можно обмотать изолентой, флористической бумагой, полосками бинта или обмазать гипсом.

Осталось сформировать дерево инь-янь из бисера, слегка переплетая межу собой стволы. Этот прием добавляет романтизма изделию.

«Посадка» дерева

Дерево из бисера инь-янь готово, осталось «посадить» его в горшочек. Емкость для такого украшения выбирается неброская, желательно черного или белого цвета.

Развести гипс по инструкции до густоты сметаны. Чтобы деревце было устойчивым, концы толстой проволоки в области «корней» загнуть плоскогубцами в виде петли. Установить дерево в горшок и залить гипсовым раствором. Пока смесь не схватится, нужно подержать заготовку, чтобы не сместилась. Потом оставить до полного застывания примерно на сутки.

На этом этапе можно обмазать ствол дерева, чтобы сделать имитацию коры. Тонкий слой гипсового раствора наносится на ствол и зубочисткой или другим острым тонким предметом делаются бороздки на не застывшем гипсе.

Можно вообще обойтись без горшочка. В этом случае понадобится плоская емкость, которая застилается целлофаном. Дерево устанавливается в этой емкости и заливается гипсом, а после высыхания достается из формы. Основа окрашивается и декорируется по желанию.

Декорирование

После полного высыхания гипса нужно нанести финальные штрихи. Если ствол покрывался гипсом, его нужно покрасить акриловыми красками или гуашью в соответствующий цвет. Краска наносится в несколько слоев. Необходимо, чтобы каждый слой полностью просыхал. Только в этом случае будут видны огрехи в окрашивании.

Основание также можно украсить по своему усмотрению. Например, выложить из бисера знак инь-янь, приклеивая бисеринки к гипсовой основе. Можно покрасить красками или задекорировать любым другим способом. Готовое изделие покрывается лаком (по желанию).

Вариации ни тему

Описанный мастер-класс дерева инь-янь из бисера является базовым. Но создание деревьев из бисера — процесс творческий и приветствуются различные отступления и полет фантазии.

Так, не обязательно, чтобы цветовая палитра была только черной и белой. Можно делать и из других контрастных цветов, которые будут смотреться не менее эффектно: из синего и красного, желтого и зеленого и из других.

Также можно поэкспериментировать со стволами. Здесь описан вариант, в котором два ствола переплетаются. Но можно, чтобы из одного основания шли разветвления разных цветов.

Форма дерева также не принципиальна. Важно, чтобы была симметричная композиция. Можно придать форму сердца или подковы. В любом случае это будет смотреться ярко и эффектно.

Узнав, как сделать дерево из бисера инь-янь, можно смело браться за работу. Это кропотливый труд, требующий не только хорошей фантазии, но и усидчивости. Но в результате получается красивое и стильное украшение для дома или запоминающийся подарок для друзей и родных.

Создание деревьев из бисера инь-янь и других вариантов – это увлекательный процесс. К созданию такого шедевра можно подключить всю семью. Дети с удовольствием нанизывают бисер на проволоку, а мужчин можно озадачить фигурным загибанием толстой проволоки. Каждый член семьи потом с гордостью скажет, что приложил руку к этому шедевру.

Бисероплетение. Деревья «инь — янь»

Необычным, оригинальным и очень приятным подарком на свадьбу, День Святого Валентина или день рождения может стать сувенир изготовленный в технике бисероплетение, дерево «инь-янь», схема которого очень проста в исполнении. О том как создать такие деревья расскажем вам ниже в нашем подробном мастер-классе.

Итак, техника бисероплетение, деревья «инь — янь» мастер-класс по шагам

Рассматривая готовую работу многим может показаться, что изготовление таких деревьев не под силу тем кто лишь осваивает бисероплетение для начинающих и что, прежде чем его изготавливать, следует еще немного подучиться этому ремеслу. На само деле это не так, конечно, создание такого сувенира из бисера требует усидчивости, терпения и временных затрат, однако это не значит что сделать его сложно, попробуйте вместе с нами и у вас обязательно все получится.

Для того чтобы вы смогли изготовить бисероплетение деревья «инь — янь», понадобятся такие материалы:

— бисер черного цвета;

— бисер белого цвета;

— медная проволока;

— черные нитки;

— белые нитки;

— небольшая емкость;

— клей ПВА;

— гипс.

Пошаговое бисероплетение деревья «инь — янь» с фото.

Первый шаг. Для изготовления данного сувенира, нам необходимо сплести два одинаковых дерева, одно белого, а второе черного цвета, а затем переплести их между собой. Начнем с изготовления веточки одного из деревьев. Для этого возьмем отрезок медной проволоки длиной сорок пять сантиметров, наденем на нее с одного конца девять бисерин черного цвета, и продвинем их так, чтобы от кончика проволоки первая бусина располагалась на расстоянии семи-восьми сантиметров.

Второй шаг. Короткий край проволоки соединяем с длинным и формируем первую петельку из бусин.

Третий шаг. Далее снова надеваем на рабочий длинный конец проволоки девять бисерин черного цвета и, отступив от первой петли один сантиметр, формируем точно такую вторую петлю из бусин. Всего нам необходимо сформировать в ряд семь петель на одинаковом расстоянии друг от друга один сантиметр.

Четвертый шаг. Затем полученную заготовку из проволоки с петельками из бисера складываем пополам, так чтобы четвертая петля оказалась по центру, а все остальные получились расположенными симметрично по отношению друг к другу.

Пятый шаг. После этого начинаем аккуратно скручивать обе половинки проволоки между собой, формируя маленькие виточки.

Шестой шаг. Когда проволока веточки будет скручена до конца, аккуратно расправляем каждую петельку и поворачиваем их в разные стороны. Как вы могли догадаться, петельки из бусин – это листики нашего будущего деревца.

Седьмой шаг. Всего по такому принципу нам необходимо сплести три одинаковых маленьких веточки, а затем объединить их в одну более крупную ветвь. Для этого мы переплетаем между собой все проволочные стебли маленьких веточек, а затем расправляем их чтобы более крупные ветки были объемными и пропорциональными.

Восьмой шаг. Всего нам необходимо сплести для одного дерева тридцать маленьких веточек и сформировать из них десять более крупных.

Девятый шаг. Когда все веточки из бисера черного цвета будут готовы, берем нить черного цвета, это могут быть обычные катушечные нити или мерсеризованная хлопчатобумажная пряжа, которую часто используют для вязания крючком, также подойдут не очень толстые шерстяные или акриловые нитки. Край нитки туго привязываем в том месте стебля, где он начинает разветвляться, и далее аккуратно обматываем проволоку густыми виточками вдоль всего стебля по направлению вниз до конца проволоки. В конце нить обрезаем и фиксируем ее при помощи капельки клея ПВА, чтобы она не размоталась. Можно еще сразу покрыть всю обмотанную нитью часть ветки бесцветным лаком для ногтей, это поможет надежно удержать намотанную нить на проволоки и придаст веточке красивый блеск.

Десятый шаг. По такому же принципу обматываем нитью все десять крупных веточек, из которых и будем формировать наше первое дерево.

Одиннадцатый шаг. После этого приступаем к формированию дерева, для этого берем одну веточку и чуть ниже приматываем к ней вторую, проволоку перекручиваем между собой.

Двенадцатый шаг. Затем добавляем третью веточку, ее мы располагаем еще немного ниже двух предыдущих и также стебли переплетаем между собой в один крупный ствол.

Тринадцатый шаг. Далее продолжаем приплетать поочередно все ветки, формируя пышную пропорциональную крону дерева.

Четырнадцатый шаг. Объединенный в один ствол концы проволоки туго обматываем по верху черной нитью и закрепляем ее при помощи клея. Если вы покрыли бесцветным лаком маленькие веточки, также вам необходимо будет покрыть и ствол дерева.

Пятнадцатый шаг. Чтобы закончить бисероплетение деревья «инь – янь», точно так же как формируем второе деревце из бисера белого цвета и обматываем его ветки, а также ствол белыми нитками.

Шестнадцатый шаг. Красиво переплетаем два дерева между собой в одно.

Семнадцатый шаг. Дальше нам необходимо закрепить наши деревья в предварительно подобранной емкости. Для этого разводим до состояния густой метаны гипс или алебастр, устанавливаем изготовленные из бисера деревья в емкость и аккуратно заливаем их, удерживая в нужном положении.

Восемнадцатый шаг. Когда гипс или алебастр полностью застынет, наносим на его поверхность слой клея ПВА, а затем засыпаем половину поверхности черным бисером, а вторую белым. Также можно по-другому задекорировать видимую поверхность гипса, к примеру, разукрасить его акриловыми красками или выполнить черно-белую аппликацию.

Бисероплетение деревья «инь — янь»

– итоговое фото

Мы показали вам один из вариантов изготовления деревьев «инь-янь», надеемся, он вам понравился и был понятен. Однако по такому же принципу создаются и другие подобные деревья. Ниже предлагаем вам несколько оригинальных фото идей на эту тему, возможно именно они смогут вдохновить вас на создания своего собственного шедевра.

Бисероплетение деревья «инь — янь» – идеи в фотографиях.

О том, какие еще можно изготовить деревья из бисера вы можете узнать на нашем сайту, к примеру мастер-класс по созданию березы из бисера, вы найдете здесь.

Дерево инь-янь из бисера и прочие украшения для дома :: SYL.ru

Одним из популярных материалов у рукодельниц является бисер. Он представляет собой бусину из стекла, пластмассы, фарфора со сквозным отверстием. Встречается бисер не только в форме шариков, но и в форме цилиндров, трубочек, зернышек, треугольников, шестигранников. Существует и фантазийный бисер, по форме напоминающий цветы, различных животных и т.д. Также этот материал отличается и по размеру.

От разнообразия цветов бисера разбегаются глаза. Бисерины имеют различную текстуру. Они могут быть гладкие, глянцевые, матовые, шероховатые. Такой материал отлично подходит для изготовления украшений. Браслеты, серьги, подвески, броши, выполненные в технике бисероплетения, выглядят очень ярко, сочно и оригинально. Бисером шьют картины. Украшают бисеринами различные поделки, сделанные собственными руками, например, открытки, фотоальбомы, вазы. Декорируют бисером одежду и обувь. Одним словом, бисер — универсальный материал, который пригодится каждой мастерице.

Особенности поделок из бисера

Изделия, выполненные в технике бисероплетения, станут отличным подарком. Достаточно придумать оригинальную идею и воплотить ее в жизнь с помощью бисера. Одной из таких идей может быть создание дерева из бисера. Подобные деревья являются символом богатства, достатка и плодородия. Они способны украсить любой интерьер. Отличным вариантом для подарка будет дерево инь-янь из бисера. Данный символ означает баланс и равновесие всего, что нас окружает. Древние китайцы считали, что каждая вещь состоит из противоположностей, но именно сочетание противоположных сил и есть основа баланса всего на земле. Дерево инь-янь из бисера станет желанным подарком для человека, увлекающегося искусством фен-шуй.

Техника производства китайских аксессуаров

Для изготовления такого сувенира понадобится бисер черного и белого цвета, тонкая и толстая проволока, цветочный горшок, черная и белая атласная лента. Необходимо взять 8-9 штук белого бисера и нанизать его на тонкую проволоку. Затем скрутить петельку.

Таких петелек на проволоке нужно сделать примерно 7-8 штук. Далее проволока с петельками складывается пополам, при этом закручиваясь между собой, благодаря чему дерево инь-янь из бисера приобретает свою основу. Петельки распрямляются, и получается белая веточка. Таких веточек необходимо сделать примерно 60 штук, можно и меньше, если дерево планируется небольшое. Таким же образом делаются 60 черных веточек. Затем 3 белых веточки соединяются в одну, переплетая при этом концы проволоки. В итоге получается 20 раскидистых белых ветвей. Таким же образом формируется и черная часть поделки. Затем толстой проволокой связываем в одну по 2 тройных веточки, после чего наматываем поверх проволоки атласную ленту так, чтобы лента покрывала 1/3 стебля. Фиксируется лента внизу тонкой проволокой. Получается 10 парных веточек, обмотанных лентой. Собирается одно белое дерево, ствол которого следует облепить белым пластилином и оформить поверх белой лентой. Такое же черное дерево переплетается с белым стволом и устанавливается в цветочный горшок. В горшочке дерево инь-янь из бисера заливается гипсом. Сам горшочек можно раскрасить в черно-белый цвет.

Южные растения из бисера

По такому же принципу можно смастерить апельсиновое дерево из бисера. Подобное творение отлично подойдет в качестве подарка на свадьбу, так как является символом плодородия. Технология изготовления апельсинового дерева такая же, что и при изготовлении дерева инь-янь. Различие в том, что бисер нужно взять зеленого цвета. В качестве апельсинов подойдут крупные оранжевые бусины. В каждую веточку, помимо 7 петелек, необходимо включать по одной петельке с оранжевой бусиной. Ствол дерева можно обвязать коричневой лентой. Когда дерево готово, его можно также зафиксировать гипсом в горшочке, а поверхность выложить зеленым бисером или покрасить в зеленый цвет и накидать оранжевых бусин.

Красота цветущих садов в ваших руках

Легко и просто формируются и прочие цветущие деревья из бисера. Такое нежное, красивое растение, как японская сакура, придется по душе каждой женщине и девушке. Веточки для сакуры формируются не петельками, а скрученными концами, на которых нанизан бисер. Лучше использовать бисер разных оттенков розвого, таким образом, сакура приобретет более реалистичный вид. Мощный красивый ствол для веточек сакуры можно сформировать из толстой проволоки. Для придания объема проволоку необходимо обернуть несколькими слоями скотча. Затем необходимо придать стволу замысловатую форму и облепить его коричневым пластилином. Далее следует поставить собранную сакуру в форму, залить ее раствором клея ПВА и воды 1:1. После засыхания раствора нужно вытащить готовое дерево из формы. Основание можно покрасить акриловыми красками в тон дерева.

Мастер клас деревья из бисера

Скачать мастер клас деревья из бисера djvu

деревья из бисера. Результат поиска: найдено материалов. Дневники () Фото (+) Группы (1). Хотелось сделать что-то разноцветное и яркое. Вот что у меня получилось из обычного бисера и проволоки. + 1 ноября года. Мастер классы» Бисероплетение» Деревья из бисера. Деревья из бисера. Џодкатегории: Бисероплетение цветов. Дерево из бисера – это настоящее чудо! При правильном изготовлении они смотрятся как живые бонсайчики, напоминают нам о нежности, весне и легком.

Читать далее. 16 0. Дерево из бисера «Цветущая вишня на камне». Мастер-класс с пошаговыми фото. Часть 2-я. Продолжаем наш мастер-класс, в котором мы создаем дерево из бисера своими руками «Цветущая вишня на камне», начало работы вы найдете здесь. Читать далее. 11 0. Как вам деревце из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо.

snt63.ru Дерево из бисера «Дионис» Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Мастер-класс бонсай из бисера для рукодельниц Мастер-класс по плетению бонсая из бисера не сложный, главное вдохновиться и запастись терпением.

В результате вы получите сказочной красоты дерево Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Глициния из бисера | Деревья из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Береза из бисера | Деревья из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Деревья из бисера для начинающих. Примеры плетения. Поделки ручной работы имеют особую ценность, пусть даже сделанные неопытным мастером и недостаточно аккуратно. Бисер — виды и советы как выбрать.

Мастер-классы создания деревьев из бисера. Дерево в стиле инь-янь. Денежное дерево. Дерево из бисера и камней. Сакура. Осеннее дерево. Дерево из бисера-1/2 Мандарин из бисера и бусин. Сборка. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 3. Текущее видео. Дерево из бисера — 1.Мандарин из бисера. Веточки. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера.

1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 4. Текущее видео. Дерево из бисера. Вишня из бисера и бусин. Пошаговый МК. Видео урок. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 5. Текущее видео. Дерево из бисера. САКУРА из бисера и бусин. Пошаговый МК. Дерево из бисера 1/2 часть. Жакаранда Дельта комнатная. Мастер класс. Пошаговый МК.

1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера.

Красивые деревья из бисера схемы плетения. Березка из бисера своими руками. Мастер-класс по изготовлению символичного дерева иньянь из бисера. Как сделать из бисера крону бонсая своими руками: мастер-класс. В начале мк, возьмите проволоку длинной примерно пол метра и проденьте на нее 8 бисеринок. Образовавшуюся петлю скрутите в два оборота. Мастер класс по изготовлению бисерного дерева своими руками с помощью набора для рукоделия. В наборе для Дерево из бисера.

Как сделать ствол из ГИПСА. МК Бонсай из бисера✔️. Творческая Семья. Мастер-класс по созданию дерева из бисера. Формирование ствола дерева из смеси шпатлевки, клея ПВА и воды. Дерево из бисера «Дионис». Цветы из бисера. Views K3 years ago. Вконтакте id, П Проволоку для оси agroru/provoloka-pchelovodn. Предлагается мастер класс о том, как изготовить из бисера классическое дерево бонсай, с коротким толстым стволом.

Для плетения используется бисер темно-зеленого цвета и проволока диаметром 0,3 мм. Порядок работ следующий: На проволоку надевается 8 бисеринок, из них получается колечко. На второй конец проволоки тоже надевается 8 бисерин, и сворачивается такое же кольцо. Это получаются зеленые листики на проволочной ветке.

На все дерево делается таких листиков, но если дерево задумано небольшое, можно обойтись и меньшим количеством. Скрутив листики по три вместе, получаем 50 веточек. Видео у.

EPUB, fb2, doc, EPUB

Похожее:

Є.п.нелін геометрія 11 клас

Всемирная история 8 клас гісем

Текст для аудіювання 8 клас з відповідями

Англійська мова 7 класс карпюк зошит 2015

Практична робота визначення коефіцієнта поверхневого натягу рідини

Гдз по матиматике за 6 клас

Індикатори вікіпедія хімія

Кросворд про плазунів з відповідями біологія

Инь янь из бисера серьги

Мастер класс плетения из бисера дерево в стиле инь-янь

Инь — ян — две противоположности, которые образуют единое целое лишь в гармоничной комбинации. Данное видео…

Этот видео урок для начинающих! Сделаем символ инь и янь по технике параллельное плетение! Для этого понадо…

Предлагаю вам сделать своими руками очень оригинальное изделие, которое украсит интерьер любого дома или станет прекрасным подарком. Мастер-класс инь-янь из бисера с пошаговым фото поможет создать настоящую красоту. Это яркое и необычное украшение, символизирующее мужское и женское начало, может стать настоящим талисманов. Я с удовольствием расскажу вам, как сделать инь-янь из бисера.

Для плетения дерева Инь-Янь нам потребуется:
Бисер двух цветов: чёрный и белый. Размер бисера №10 или №12 (китайский)
Проволока диаметром 0,3 мм.
Нитки для обмотки двух цветов: белые и чёрные
Акриловые краски: белые,чёрные
Клей ПВА.

Для цельного дерева Инь-янь нужно сплести 2 одинаковых маленьких деревца, отличие в них только в том, что деревья будем плести разного цвета. Одно дерево будит белым, а второе чёрным. В процессе эти два дерева соединим между собой и получим красивое дерево Инь-Янь из бисера, которое украсит любой интерьер.

На отрезок проволоки длиною 45 см набираем 9 чёрных бисерин, продвигаем их на 7-8 см от края проволоки и делаем петельку.

Далее на рабочий — длинный конец проволоки набираем 9 чёрных бисерин и делаем вторую петельку

Всего нужно сделать 7 петелек. Петельки должны быть примерно около 1 см друг от друга.

Теперь берём проволоку с петельками, сначала сгибаем их друг к другу, а потом начинаем скручивать их между собой.

Далее нужно все петельки повернуть так, чтобы они были перпендикулярно самой верхней петельке. А ряд петелек, который посередине ещё и поворачиваем так, что бы эти петельки были между петельками верхнего и нижнего ряда.

После нужно все петельки слегка приподнять.

Плетём 3 штуки таких веточек.

Далее из этих веточек делаем одну веточку побольше. Для этого нужно три веточки соединить вместе.

Аналогичным плетением делаем такую же веточку, но только из белого бисера.

Всего нужно сделать 10 чёрных веточек и 10 белых веточек.

Сборка дерева инь-янь

Прежде чем приступить к сборке дерева Инь-Янь из бисера, нужно для начала на каждой веточке проволоку обмотать нитками. Веточки из чёрного бисера обматываем чёрными нитками, а веточки из белого бисера обматываем белыми нитками.

Когда обмотали все веточки, приступаем к сборке. Берём веточку из чёрного бисера – эта веточка будет центральной. Приматываем к ней чуть ниже вторую веточку. С другого бока, приматываем ещё веточку.

Тут же между этими веточками приматываем ещё веточку.

Чуть ниже приматываем по кругу ещё три веточки. Оставшиеся три веточки приматываем ниже так же по кругу. В итоге получилось 3 ряда из веточек.

Далее подставляем толстую проволоку. Если проволока не очень толстая, для её утолщения, её можно обмотать малярным скотчем. Потом до самого низу обматываем получившийся ствол чёрными нитками.

Деревце из белого бисера собираем аналогично деревцу из чёрного бисера. Теперь берём готовые деревца и скручиваем их между собой. Для готового деревца делаем подставочку из алебастра.

Плетение дерева инь-янь из бисера под силу даже начинающим, а профессионалы получат настоящее удовольствие от создания данной модели. Готовое изделие вы можете посмотреть в этом фотоальбоме.

Дерево из бисера в стиле инь-янь пользуется популярностью в рукоделии, поскольку его легко делать начинающим умельцам. Выбирают его не зря, техника плетения проста, а внешне выглядит очень броско и интересно за счет своей расцветки.

Создавая дерево инь янь, от рукодельницы требуется особое внимание, терпение, усидчивость. Запаситесь предвкушением своего творения и Вы останетесь довольны своей работой, обязательно найдете место или уголок, где разместить собственное живописное искусство.

Самым популярным древнекитайским символом на планете является символ Инь-Янь. Согласно философии даосизма, он означает единство противоположностей: черного и белого, солнце и луны, добра и зла, мужчины и женщины, которые не могут существовать друг без друга и вместе составляют мир. Мастер-класс о том, как самостоятельно сделать дерево Инь-Янь из мелкого бисера, еще и своими руками, очень понятный, но в то же время простой, даже новичок справится с заданиями.

Данное дерево может стать замечательным подарком для родителей на годовщину свадьбы, молодожен или же просто близкому человеку. Готовое изделие станет прекрасным дополнением интерьера дома или офиса. Как сделать такое чудо, вы узнаете из нашего материала.

Из чего делается дерево Инь-Янь:

бисер черного цвета — 150 гр;
бисер белого цвета — 150 гр;
бисерная проволочка — 3 катушки;
толстая алюминиевая проволока — 1 метр;
форма для подставки;
нитки мулине черного и белого цветов — по 20 грамм;
клей ПВА;
краски белого и черного оттенков;
гипс;
кисточки.

В этой части статьи можно узнать, как сплести ветки для будущего дерева. Для начала необходимо подготовить катушки с бисером.

Чтобы дерево смотрелось более реалистично, а ветви казались воздушными, лучше использовать тонкую проволоку нейтрального оттенка.

Сделать аналогичный отступ от крайней петельки и аккуратно обрезать проволоку. Когда закончится работа над петлями, можно начинать сборку заготовки для Инь-Янь. На фото показано, что начинать нужно от центрального элемента. Скрутить проволочку, а после последних двух петелек прокрутить ее примерно на 3-4 см.

Чтобы дерево смотреть более аккуратно, нужно расправить веточки. Далее нужно сделать 70 белых и 100 черных заготовок.

Если хотите, чтобы дерево Инь-Янь вышло более пышным и нарядным, плетение цветков заставит его зацвести. Сначала нужно сделать цветок черного цвета. Для этого необходимо набрать на проволоку бисер белого цвета в количестве восьми штук и у основания скрутить петлю на два-три оборота.

Набрать 16 бисерин черного цвета, обвести вокруг белой петли и скрутить у основания. Затем снова набрать восемь бисеринок белого цвета и скрутить на 2 оборота. Обвести черные бисерины (15-16 штук) вокруг петли белого цвета.

Так же сделать еще три лепестка, после соединить все элементы и поместить по центру бусинку. Обмотать проволоку флорлентой. Необходимо взять 7 бисеринок на проволоку, сделать петельки. Далее изготовить несколько штук, прикрепить к цветку и зафиксировать с помощью флорленты. Так же сделать листочки для белого цветочка.

В классическом варианте черные ветки накрывают ветки белого цвета. Обе веточки Инь-Янь располагаются в форме сердца. Как сделать заготовки готовым изделием? Для начала сделать заготовки для черных веточек. Затем отрезать кусок проволоки длиной не более 20 сантиметров и в диаметре 1,2 миллиметра. Примотать черные заготовки с помощью черной нити (белые ветки крепятся к каркасу ствола).

Сразу скажу, что это — подарок. Идею вынашивала давно. Есть у меня замечательная подруга Инна. А у неё — 13-летняя дочечка Яна. И как-то так повелось, что называли мы их всегда Инь и Ян. Вот отсюда и подарок :)))

Итак, приступаем. Начнём с чёрного цветочка. Для него — не удивляйтесь! — набираем 8 белых бисерин и скручиваем у основания петлю на 2-3 оборота.

Дальше на один конец проволоки снова набираем 8 белых бисерин, скручиваем на 2-3 оборота.

Точно так же на другом конце проволоки делаем третий лепесточек.

Вот они — наши три лепестка!

Отдельно на проволоке делаем ещё 2 таких же лепесточка — для цветка нам их нужно 5!

Соединяем, в центр вставляем крупную бусину.

проволоку обматываем флорлентой.

Вот он — наш первый цветочек! Но ему ещё нужны листики!

Листики плетём стандартно — петельки из семи бисерин. Одна по центру.

. и две по краям.

Вот начало нашей веточки.

Количество листочков — произвольно.

Для одного цветка нам нужно три ветки с листочками.

Приматываем их к нашему цветку.

Фиксируем флорлентой.

Вот он — наш первый цветочек с листиками!

Точно так же плетём белый цветок. В моём дереве было 11 белых и 11 чёрных цветов.

Дальше собираем наши деревья. Для этого берём два куска толстой проволоки и к ним приматываем наши веточки с цветами и листьями. Фиксируем их флорлентой. У основания стволы утолщаем малярным скотчем, а затем снова обматываем флорлентой. Дальше красиво переплетаем их между собой и сажаем в подходящую посуду (гипс с водой 1:1). Ствол и ветки обмазываем смесью гипса и ПВА 1:1.

Затем ветки красим акриловой краской — у белого дерева — белой, у чёрного — чёрной. Этой же краской рисуем символ Инь-Ян, который затем будем посыпать бисером. Так как бисера для этого мне потребовалось много, то в данном случае использовала суперклей. Сверху, как всегда, покрыла бесцветным лаком с блёстками. «Посудина» у меня была квадратная, а символ Инь-Ян всё-таки подразумевает круг. Поэтому в углах клеила перламутровые белые бусины разной величины, чтобы добиться более круглой формы. Всё. На мой взгляд, довольно миленькое и неординарное деревце получилось! Думаю, Инне и Яне должно понравиться. Посмотрим :))) Всем удачи! Творите, пишите и выставляйте свои работы! Буду ждать.

Как еще можно использовать символ?

Символ инь-янь очень часто используется мастерами в рукоделии и других видах творчества. Если рассматривать плетение из бисера, он может стать отличной идеей для комплекта из серег, колье или кулона, браслета, брелока.

Для плетения символа инь-янь удобнее всего использовать мозаичное плетение, начиная работу из центра круга. Освоить мозаичное плетение помогут фото и видео уроки. В первом ряду набирается 5 бисерин, стягиваются в плотное кольцо и закрепляются узелком. Один конец при этом длиннее другого. На длинный конец надевать по 1 бисеринке, ведя иглу через 1 предыдущего ряда. В третьем ряду добавляется по 2 бисерине, а в 3 — по 1.

Таким образом, по схеме плетется все изделие. В 6 ряду нужно максимально аккуратно и ровно начать плести кружочки противоположного цвета. Для серег понадобится 14 рядов, в последнем из которых нужно закрепить швензу. А если взять более крупный бисер, то в комплект можно точно так же сплести и кулон.

Заключительные этапы с подробным описанием

Подготовить смесь из клея ПВА, гипса и воды. Тщательно промазать каждую веточку и низ ствола. Затем нужно придать стволу текстуру. Для этого необходимо прорезать кору на застывающей гипсово-клеевой смеси. Дать изделию затвердеть. Сделать несколько отверстий для помещения декора с помощью шила.

Теперь можно приступить к покраске. Необходимо взять кисточку и гуашью покрасить верхнюю ветку в черный цвет до того места, где ветки пересекаются. Нижнюю ветвь и ствол покрасить в белый, затем все просушить. С помощью жесткой сухой кисточки покрасить черной краской низ ствола, корни и подставку. Оставить все высохнуть. Дерево Инь-Янь из бисера готово!

Символика инь-янь из бисера

Инь-Янь — один из самых распространенных и понятных символов восточной мифологии. Белое и черное, женщина и мужчина, добро и зло… Одного не может быть без другого. Такой философский подарок можно подарить на юбилей свадьбы, молодоженам и просто любимому человеку. А чтобы он был всегда на виду, можно сделать своими руками красивое дерево «Инь-Янь» из бисера.

Что для этого понадобится?

бисер-рубка белого и черного цвета по 150 г;

тонкая проволока для веток и потолще для ствола;

лоскогубцы;

кисточка;

шерстяная нитка черного и белого цвета;

подставка из гипса;

немного белой и черной краски.

Как это сделать?

Нарезать для веточек 60 отрезков тонкой проволоки длиной 45 см. Обычно для плетения бисером-рубкой подходит толщина около 0,3 мм.

Взять один такой отрезок и одеть на него 9 черных бисерин. На расстоянии 8-9 см от края сделать из них небольшую петельку, скрутив концы проволоки между собой.
Начинаем плетение веточек дерева из бисера

На длинном конце проволоки таким же образом сделать еще 6 петелек. Расстояние между ним должно быть около 1 см.

Теперь нужно сложить проволоку пополам. Одна петелька будет вверху, а другие соединить попарно и скрутить проволоку.
Скручиваем проволоку и получаем веточку нашего дерева

Чтобы веточка выглядела более натуральной, «листочки» расправить и повернуть в разные стороны вокруг своей оси. Немного приподнять.

Сделать еще 2 таких веточки. А затем соединить все 3 заготовки в уже одну ветку покрупнее.

Точно таким же образом делается и белая ветка. Всего понадобится для одного дерева по 10 веток каждого цвета.
Для одного дерева понадобится не менее 10 веток каждого цвета

Перед тем, как собрать их все в одно целое, нужно каждую обмотать ниткой соответствующего цвета. Делать это как можно плотнее, чтобы проволока не проглядывала.

Теперь можно приступить к сборке. К одной веточке примотать чуть ниже вторую. С другой стороны точно так же присоединить третью. И между ними разместить еще и четвертую.

Затем чуть ниже по кругу вплести еще 3 ветки. Это будет второй ряд веточек. И третьим рядом добавить по одной оставшиеся 3 ветки.

Чтобы ствол дерева был более прочным, малярным скотчем закрепить более толстую проволоку и плотно обмотать черной нитью. Темная часть дерева готова.
Обматываем стволик дерева мялярным скотчем , а затем сверху черной нитью

Теперь точно также подготовить вторую белую часть. Остается только их соединить между собой.
Соединяем белый и черный стволики дерева

В качестве подставки можно использовать любой горшочек или изготовить ее самостоятельно из гипса или алебастра.

В любую пластиковую емкость (конечно, лучше если она будет круглой) налить раствор из гипса, воды и клея ПВА. Она должна быть гибкой, чтобы ее потом было легче удалить.

В него посадить дерево «Инь-Янь» из бисера, немного подержать, чтобы подставка схватилась. Оставить до полного высыхания на сутки.

На последнем этапе покрасить дерево в нужные цвета. В нашем случае черной и белой краской. Просто кисточкой на ствол, ветки и подставку ее нанести. Для красоты можно выкрасить саму подставочку наоборот. Белое дерево может расти из черной «земли», а черное — из белой.

После того, как краска высохнет, нанести прозрачный лак. Это не только придаст блеска готовой работе, но и продлить ей жизнь. Как только он высох, дерево «Инь-Янь» готово.

Однако не стоит зацикливаться на черно-белой гамме, по желанию его можно сделать своих любимых цветов. Это может быть желто-зеленое или бело-красное дерево. К тому же увеличивая или уменьшая количество веток, можно сделать и само дерево разных размеров.

А что можно сделать еще?

Конечно, такой деревце станет отличным украшением интерьера. Но инь-янь из бисера может стать отличной основой для целого комплекта украшений. Серьги, браслеты и кулоны с этим символом выглядят весьма оригинально и ярко. Правда, не у всех получается сплести ровный круг «Инь-Янь» из бисера. Схема работы, к сожалению, тоже не всегда выручает.

Круг «Инь-Янь» из бисера можно использовать для брелка

Проще всего для такой работы использовать мозаичное плетение. Плести символ Инь-янь из бисера начинают с центра. Для первого ряда просто набрать 5 бисерин. Затем стянуть их в плотное кольцо и завязать узелок. При этом один конец должен быть длиннее другого. На более длинный нанизывать по одной бисерине, продевая иглу через одну предыдущего ряда. В третьем ряду нужно будет добавлять уже по 2 штуки, а в четвертом — по одной.

Таким образом плести согласно схеме весь круг. Главное, не забыть в шестом ряду начать вплетать бисер другого цвета для маленьких кружочков. Делать это нужно максимально ровно. Всего для серег понадобится четырнадцать рядов, выполненных мозаикой. В последнем ряду закрепить швензу, закрепить готовое изделие и спрятать концы нити. На этом серьги Инь-Янь готовы, также можно сделать и кулон к ним. Только использовать бисер по крупнее.

Мастер клас деревья из бисера

Скачать мастер клас деревья из бисера txt

Мастер-классы и схемы плетения деревьев из бисера. Бисероплетение деревьев относительно легкое направление в этом виде рукоделия. Такую технику может освоить даже начинающая юная рукодельница. Всем известно, что дети любят мастерить своими руками, но если техника выполнения трудоемкая и сложная, девочки быстро теряют интерес.

Плетение деревьев из бисера популярно как на детских творческих кружках, так и для взрослых мастериц. Это увлекательное и красивое рукоделие, при помощи которого можно создать поразительную декорацию для дома, офиса и даже на подарок. Встречая осень. Как сделать березу из.

Мастер-классы создания деревьев из бисера. Дерево инь-янь. Бисерное дерево типа «Инь-янь» — это интересная самоделка, которую не стыдно поставить на рабочий стол. Их можно даже продавать, а плетутся они просто: Понадобится черный и белый бисер, ниточка и крепкая проволочка.

Отрезаем полметра проволоки. Нужна бисерная проволока и сами бусины. Можно сделать ее в одном цвете, но тогда деревце получится неприглядным, тусклым и скучным. Правильнее будет купить несколько оттенков розового, чтобы получить небольшие переливы, которые сделают поделку объемнее.

Посмотреть видео о том, как плести из бисера пошагово для начинающих, можно посмотреть ниже. Береза. Деревья из бисера формируются по принципу: от частного – к общему. Вначале работаем только тонкой проволокой и бисером.

В чашку высыпаем бусинки необходимого цвета, перемешиваем, если нужно использовать два или три оттенка, и начинаем набирать на проволоку. Материалы для работы Как сделать дерево из бисера своими руками Деревья из бисера – фото идеи Схемы плетения деревьев из бисера Видео мастер-класс: дерево из бисера для начинающих. Бисероплетение позволяет создать любые объёмные фигуры, среди которых особняком стоят деревья.

По сути, каждая ветка – плоская, однако когда они собираются вместе, получается весьма объёмное дерево из бисера. Мастер классы» Бисероплетение» Деревья из бисера. Деревья из бисера. Џодкатегории: Бисероплетение цветов. Дерево из бисера – это настоящее чудо!

При правильном изготовлении они смотрятся как живые бонсайчики, напоминают нам о нежности, весне и легком. Читать далее. 16 0. Дерево из бисера «Цветущая вишня на камне». Мастер-класс с пошаговыми фото. Часть 2-я. Продолжаем наш мастер-класс, в котором мы создаем дерево из бисера своими руками «Цветущая вишня на камне», начало работы вы найдете здесь.

Читать далее. 11 0. Ознакомьтесь с самыми подробными схемами плетения деревьев из бисера своими руками. Поэтапный мастер-класс для начинающих с лучшими фото-обзорами готовых изделий. Любая поделка, созданная своими руками, представляет особенную ценность, даже если в ее внешнем виде можно обнаружить некоторые недочеты.

Представляю вам пошаговый мастер-класс по созданию небольшого дерева из бисера своими руками, нежного серебристо-сиреневого оттенка «Зимний ажур». Цветовое решение сувенира – важный момент при подготовке к изготовлению этого деревца, подберите тон бисера и чашку (стеклянную или фарфоровую), чтобы они гармонировали друг с другом.

Для работы нам понадобится: 1) чешский (или любой другой) бисер № (также подойдет рубка) – грамм. 2) проволока толщиной 0,,5 мм, около 75 метров, медная или подходящего цвета.

3) ножницы для резки проволоки (подойдут обычные, которые не жалко). Для плетения деревьев из бисера вам пригодится: бисер подходящих цветов; тонкая нитевидная проволока; игла Мастер-класс по плетению березы. Для работы возьмите бисер 3 оттенков зеленого, медную проволоку в 0,2 мм диаметром и то, что станет основанием для деревца (емкость, алебастр).

Обмотать ствол можно белыми вышивальными нитками. Деревья из бисера – мастерство, которое по силам даже начинающим мастерицам. Бонсай, денежное дерево, деревья любви из бисера разных оттенков с примерами оформления. Содержание статьи: Как правильно сделать дерево из бисера своими руками (уроки для начинающих). Как сплести денежное дерево из бисера. Как сделать осеннее дерево из бисера. Как сделать дерево Инь-Ян из бисера. Как сделать дерево бонсай из бисера. Как сделать зимние деревья из бисера.

Видео. Плетение из бисера – древнее занятие, которое не потеряло популярности и в наше время.

djvu, doc, fb2, txt

Похожее:

Регуляція функцій рослинного організму презентація

14 жовтня день захисника вітчизни презентація

Історія стародавнього світу 6 клас читати онлайн

Гдз українська мова 7 клас глазова кузнецов вправа 496

Данильченко фрадіна хімія 8-9 класс

Инь-янь дизайна очевидна в кондоминиуме Tavira

Vogue Interiors

, предоставлено Caffrey & Amp; Ассоциированные компании

Создание очаровательных пространств для пар, чьи индивидуальные вкусы находятся на противоположных концах спектра, может создать множество проблем даже для самых опытных дизайнеров интерьеров. Независимо от того, были ли пара вместе в течение относительно короткого периода времени или прожили вместе десятилетия, уравновешивание его и ее личных предпочтений может быть сродни разговору Инь-Ян.Степень успеха дизайнера зависит от его способности создавать среду, которая способствует позитивному, гармоничному взаимодействию между разрозненными элементами.

Дизайн интерьеров Vogue Interiors в кондоминиуме с тремя спальнями площадью 3800 квадратных футов в Тавире в районе Бонита-Бэй является ярким примером того, как можно сочетать противоположные индивидуальные вкусы таким образом, чтобы удовлетворить чувства и сделать их очень пригодными для жизни. Этот отель принадлежит канадской паре Удо и Ингрид Петерсен, которые вместе уже 47 лет. Из него открываются фирменные виды Тавиры на залив Эстеро и Мексиканский залив.Пара путешествовала по миру и разделяет увлечение Африкой. Как быстро выяснил Vogue, на этом общие вкусы заканчиваются.

«Дизайнерские вкусы Ингрид явно традиционны, и ей нравится включать элементы, которые имеют немного блеска», — сказала Дженис Маскелл из Vogue, лицензированный дизайнер интерьеров из Флориды. «Вкусы Удо очень современные. Общим элементом была их любовь к африканскому искусству и африканским предметам, собранным во время путешествий. Их коллекция произведений искусства также включает красочные, более современные работы.Я хотел взять их особенные произведения искусства и включить их в переходный дизайн, который будет оптимистичным, чистым и теплым, позволяя искусству сливаться с их новой мебелью. Чтобы традиционные и современные элементы работали вместе, я решил использовать нейтральную цветовую палитру с серо-коричневыми, немного черного и вкраплениями красного, цитрусового и зеленовато-желтого. Большая часть цвета в доме создается произведениями искусства. Полы из камня и мытого дерева создают ощущение органичности.”

Маскелл создает акцент на деревянном полу в вестибюле лифта дома, где два оригинальных произведения африканского искусства служат прелюдией к работам, представленным внутри резиденции. Африканскую тему продолжают два стула, отделанные зебровым принтом. Потрепанная консоль со средне-коричневой отделкой из красного дерева контрастирует с богатой отделкой стен с текстурой гальки, выполненной в металлической бронзе. Чтобы придать помещению блеск, кессонный потолок отделан листовым серебром с золотой глазурью.Современная люстра придает дополнительный блеск.

Двустворчатый вход ведет в просторное фойе, откуда открывается характерный для Тавиры «вид на миллион долларов». Maskell представляет дополнительные африканские произведения искусства и усиливает тему ковриком из шкуры животного, установленным поверх инкрустации из мытого дерева. Традиционный диван располагается в нише, созданной специально для этого предмета, и играет против консоли с зеркальным фасадом. В фойе есть кессонный потолок с отделкой эспрессо, который соответствует специально разработанным колоннам, которые сообщают о входе в гостиную.Еще одна сверкающая современная люстра завершает очаровательный вид фойе.

Первоначальный план дома предусматривал большое пространство, обычно используемое для гостиной и столовой. Поскольку пара любит развлекаться, Маскелл решил отказаться от обеденной зоны и сделать все пространство местом для встреч на закате и коктейльных вечеринок. Накладные молдинги на стенах, отделанные эспрессо, и лепнина в короне соответствуют тону уникальной угловой накладки камина, которая включает в себя обрамление, выполненное из текстурированного материала серебряного напольного покрытия.

«Зона развлечений продолжает сочетание традиционных и современных элементов», — сказал Маскелл. «Диваны в тон светло-серо-коричневого цвета имеют органическую текстуру, подчеркнутую подушками цитрусового и зеленовато-желтого цветов. Один из диванов соединяет группу с современным журнальным столиком для эспрессо овальной формы, парой боковых стульев с серо-коричневой отделкой и тканью с металлической кожей, а также более традиционными скамейками с ковшом в африканском стиле. Единственный в своем роде коврик, отделанный под старину, имеет слабый узор, который приобретает цвет цитрусовых.Второй диван находится в том, что изначально было обеденной зоной. Вокруг него стоят кресла с леопардовым принтом, а напротив него стоит большой настенный телевизор. Интересный коктейльный столик имеет выдвижной поднос с зеркальной столешницей. Торцы стола обиты мягкой тканью, поэтому поднос можно перемещать из стороны в сторону, открывая подставку для ног ».

Открытая кухня дома примыкает к развлекательной зоне. Мебель из фальш-панелей, отделанная мускатным орехом, столешницы из черного гранита, большой остров, установленный над инкрустацией пола из мытого дерева, и комплект бытовой техники Wolfe — все вместе создают уютное и очень функциональное пространство.Maskell привносит блеск на кухню с металлической панелью из стеклянной плитки цвета бронзы. Столешница Peninsula оборудована двойной мойкой из нержавеющей стали и тремя барными стульями.

Маскелл преобразовал то, что задумывалось как зона семейной комнаты, в столовую и зону отдыха с видом на поле для гольфа. Круглый обеденный стол из дерева вмещает четыре стула с мягкой обивкой, украшенных современным принтом в лимонных тонах и с небольшим отблеском серебра. Отдельно стоящий бархатный диванчик обеспечивает дополнительные места для сидения.Зона отдыха включает в себя компьютерный стол с отделкой для эспрессо, плавающие полки для эспрессо и пару удобных кресел, выполненных из текстурированной серо-коричневой ткани.

Вестибюль с деревянным полом ведет к входу в главную спальню с двумя дверьми. В главной спальне есть зона отдыха с парой светло-серо-коричневых больших стульев из моющегося льна, традиционная консоль эспрессо с дверцами из пергаментного полотна и большой телевизор. Мягкое зеленое изголовье кровати с серебряными блестками простирается до потолка, создавая эффект «вау».Постельное белье представлено в лимонной, зеленоватой и серо-коричневой цветовой гамме. В качестве прикроватных тумб используются сундуки для эспрессо с деревянными дверными фасадами светлых тонов и круглыми никелевыми ручками. Крупные произведения современного искусства придают помещению дополнительный колорит.

В главной ванне пол из камня и мытого дерева, а также каменная рамка ванны подчеркнуты инкрустацией из цыпленка серого и бронзового цвета. Умывальники, отделанные мускатным орехом, увенчаны столешницами из мягкого кремового мрамора. Современные бра, драпированные серебряными бусинами, служат ярким знаком препинания.

«Готовый дизайн сохраняет характер различных стилей мебели», — сказал Маскелл. «Одно не подавляет другого. Они прекрасно сочетаются друг с другом, создавая обстановку, в которой яркие цвета произведений искусства сочетаются очень естественно и объединяют законченный вид, а не доминируют в пространстве. Взаимодействие различных стилей и цветов создает гармонию, которая делает дом очень привлекательным и удобным ».

Компания Vogue Interiors, основанная в 1979 году, была отмечена многочисленными национальными, региональными и местными наградами, в том числе тремя подряд наградами Aurora Awards, высшей наградой, присуждаемой Конференцией строителей Юго-Востока в 12 штатах.В корпоративных офисах по адресу 24520 Production Circle в Бонита-Спрингс, Флорида, Vogue Interiors предоставляет услуги по дизайну и модельный мерчендайзинг частным и коммерческим клиентам в США и за рубежом. На сайте vogueinteriors.com.

Инь-Ян дизайна, очевидный в Vogue Interiors ‘Tavira Condo — Vogue Interiors

Создание увлекательных пространств для пар, чьи индивидуальные вкусы находятся на противоположных концах спектра, может создать множество проблем даже для самых опытных дизайнеров интерьеров.Независимо от того, были ли пара вместе в течение относительно короткого периода времени или прожили вместе десятилетия, уравновешивание его и ее личных предпочтений может быть сродни разговору Инь-Ян. Степень успеха дизайнера зависит от его способности создавать среду, которая способствует позитивному, гармоничному взаимодействию между разрозненными элементами.

Дизайн

Vogue Interiors в кондоминиуме площадью 3800 квадратных футов с тремя спальнями в высотном здании Tavira в районе Бонита-Бэй является ярким примером того, как можно сочетать противоположные вкусы таким образом, чтобы удовлетворить чувства и сделать их очень пригодными для жизни.Этот отель принадлежит канадской паре Удо и Ингрид Петерсен, которые вместе уже 47 лет. Из него открываются фирменные виды Тавиры на залив Эстеро и Мексиканский залив. Пара путешествовала по миру и разделяет увлечение Африкой. Как быстро выяснил Vogue, на этом общие вкусы заканчиваются.

«Дизайнерские вкусы Ингрид явно традиционны, и ей нравится включать элементы, которые имеют немного блеска», — сказала Дженис Маскелл из Vogue, лицензированный дизайнер интерьеров в штате Флорида.«Вкусы Удо очень современные. Общим элементом была их любовь к африканскому искусству и африканским предметам, собранным во время путешествий. Их коллекция произведений искусства также включает красочные, более современные работы. Я хотел взять их особенные произведения искусства и включить их в переходный дизайн, который будет оптимистичным, чистым и теплым, позволяя искусству сливаться с их новой мебелью. Чтобы традиционные и современные элементы работали вместе, я решил использовать нейтральную цветовую палитру с серо-коричневыми, немного черного и вкраплениями красного, цитрусового и зеленовато-желтого.Большая часть цвета в доме создается произведениями искусства. Пол выложен камнем с акцентом на мытое дерево, что создает ощущение органичности ».

Maskell создает акцент на деревянном полу в вестибюле лифта дома, где два оригинальных произведения африканского искусства служат прелюдией к работам, представленным внутри резиденции. Африканскую тему продолжают два стула, отделанные зебровым принтом. Потрепанная консоль со средне-коричневой отделкой из красного дерева контрастирует с богатой отделкой стен с текстурой гальки, выполненной в металлической бронзе.Чтобы придать помещению блеск, кессонный потолок отделан листовым серебром с золотой глазурью. Современная люстра придает дополнительный блеск.

Двустворчатый вход ведет в просторное фойе, откуда открывается характерный для Тавиры «вид на миллион долларов». Maskell представляет дополнительные африканские произведения искусства и усиливает тему ковриком из шкуры животного, установленным поверх инкрустации из мытого дерева. Традиционный диван располагается в нише, созданной специально для этого предмета, и играет против консоли с зеркальным фасадом.В фойе есть кессонный потолок с отделкой эспрессо, который соответствует специально разработанным колоннам, которые сообщают о входе в гостиную. Еще одна сверкающая современная люстра завершает очаровательный вид фойе.

Первоначальный план дома предусматривал большое пространство, обычно используемое под гостиную и столовую. Поскольку пара любит развлекаться, Маскелл решил отказаться от обеденной зоны и сделать все пространство местом для встреч на закате и коктейльных вечеринок. Накладные молдинги на стенах, отделанные эспрессо, и лепнина в короне соответствуют тону уникальной угловой накладки камина, которая включает в себя обрамление, выполненное из текстурированного материала серебряного напольного покрытия.

Открытая кухня дома примыкает к развлекательной зоне. Мебель из фальш-панелей, отделанная мускатным орехом, столешницы из черного гранита, большой островок над инкрустацией из мытого дерева и комплект бытовой техники Wolfe — все вместе создают уютное и очень функциональное пространство.Maskell привносит блеск на кухню с металлической панелью из стеклянной плитки цвета бронзы. Столешница Peninsula оборудована двойной мойкой из нержавеющей стали и тремя барными стульями.

Вестибюль с деревянным полом ведет к двустворчатому входу в главную спальню. В главной спальне есть зона отдыха с парой светло-серо-коричневых больших стульев из моющегося льна, традиционная консоль эспрессо с дверцами из пергаментного полотна и большой телевизор. Мягкое зеленое изголовье кровати с серебряными блестками простирается до потолка, создавая эффект «вау».Гламурное постельное белье представлено в лимонной, зеленовато-коричневой и серо-коричневой цветовой гамме. В качестве прикроватных тумб используются сундуки для эспрессо с более светлыми тонированными дверными фасадами из дерева с капюшоном и круглыми никелевыми ручками. Крупные произведения современного искусства придают помещению дополнительный колорит. В главной ванне пол из камня и мытого дерева, а также каменная окантовка ванны украшены серо-бронзовой инкрустацией из цыпленка. Умывальники, отделанные мускатным орехом, увенчаны столешницами из мягкого кремового мрамора. Современные бра, драпированные серебряными бусинами, служат ярким знаком препинания.

Основанная в 1979 году, Vogue Interiors была отмечена многочисленными национальными, региональными и местными наградами, в том числе тремя подряд наградами Aurora Awards, высшей наградой, присуждаемой Конференцией строителей Юго-Востока в 12 штатах.В корпоративных офисах по адресу 24520 Production Circle в Бонита-Спрингс, Флорида, Vogue Interiors предоставляет услуги по дизайну и модельный мерчендайзинг частным и коммерческим клиентам в США и за рубежом. Посетите Vogue Interiors на сайте vogueinteriors.com.

Инь Ян 1 — критический регулятор развития В-клеток

Huifei Liu1,
Марк Шмидт-Супприан1,2,
Юйцзян Ши1,7,
Элиас Хобейка3,
Наташа Бартенева1,4,
Hassan Jumaa3,
Роберта Пеланда3,8,
Майкл Рет4,
Джейн Скок5,6,
Клаус Раевски1,2, и
Ян Ши 1,9

¹ Отделение патологии, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс 02115, США;
² CBR Institute for Biomedical Research, Inc., Бостон, Массачусетс 02115, США;
³ Институт биологии III, Фрайбургский университет Альберта-Людвига и Институт иммунобиологии Макса Планка, 79108 Фрайбург,
Германия;
⁴ Основная установка проточной цитометрии, CBR Institute for Biomedical Research, Inc., Бостон, Массачусетс 02115, США;
⁵ Отделение иммунологии и молекулярной патологии, Отделение инфекций и иммунитета, Университетский колледж Лондона, Лондон, W1T
4JF, Великобритания

Аннотация

Роль транскрипционного фактора Yin Yang 1 (YY1) в развитии в значительной степени неизвестна.Здесь мы показываем, что специфическая абляция
YY1 в B-клетках мыши вызвали дефект соматической перестройки в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина ( IgH ) и блокировку перехода B-предшественника в B-клетку-предшественник, который был частично устранен предварительно перегруппированным Трансген IgH . Трехмерный ДНК-флуоресцентный анализ гибридизации in situ выявил важную функцию YY1 в сокращении локуса IgH , процесс, необходимый для дистальной рекомбинации V _H от до D _H J _H .Мы предоставляем доказательства того, что YY1 связывает интронный энхансер Eiμ в локусе IgH , что согласуется с прямой ролью YY1 в рекомбинации V _H D _H J _H . Эти находки идентифицировали YY1 как критический регулятор раннего развития B-клеток.

Развитие

B-лимфоцитов проходит через стадии предшественника (про-B), предшественника (пре-B), незрелых и зрелых B-клеток.
(Харди 1989).Каждая стадия определяется статусом рекомбинации и паттерном экспрессии генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина ( IgH и IgL ) и маркеров клеточной поверхности (Hardy et al. 2000; Hardy and Hayakawa 2001; Cancro 2004; Jung и Alt 2004). Гены Ig (также известные как гены В-клеточного рецептора или гены антител) собираются негомологичной перестройкой из переменной ( V ), Diversity ( D ) (только H ) и Joining ( J ) генные сегменты, опосредованные рекомбиназой гена, активирующего рекомбинацию (RAG) (Jung and Alt 2004).Перестройка локусов Ig — это упорядоченный процесс (Alt et al. 1984; Chowdhury and Sen 2004). В про-В-клетках перегруппировка D _H в J _H происходит до рекомбинации V _H в D _H J _H. После генерации продуктивно реаранжированного фрагмента V _H D _H J _H и экспрессии μ-цепи про-В-клетки переходят на пре-В-клеточную стадию развития. Выраженная μ-цепочка,
в сочетании с суррогатной легкой цепью λ5 и VpreB и гетеродимерами Ig-α / β образует пре-B-клеточный рецептор (пре-BCR),
который сигнализирует об экспансии пре-В-клеток и последующей перестройке гена легкой цепи (Fleming and Paige 2001).По завершении перестройки легкой цепи две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи вместе с
гетеродимеры Ig-α / β образуют рецептор B-клеток, а пре-B-клетки переходят к незрелым B-клеткам, которые покидают костный мозг
(BM), чтобы стать зрелыми периферическими B-клетками.

Специфичность клонов и стадий развития рекомбинации V (D) J зависит от локальной доступности локусов гена для общей рекомбиназы RAG, которая функционирует как в B-
и перестройки генов рецепторов Т-клеток (Chowdhury and Sen 2004; Jung and Alt 2004).Локус IgH становится доступным для рекомбиназы RAG в про-B-клетках, что сопровождается рядом изменений, включая переход от периферии к центру.
репозиционирование ядра, сокращение локуса, опосредованное петлей ДНК, экспрессия транскрипта зародышевой линии и ковалентные модификации
гистонов в определенных участках (Янкопулос и Альт 1985; Чоудхури и Сен 2001; Косак и др. 2002; Морсхед и др. 2003; Су и др. 2003; Болланд и др. 2004; Фукса и др. 2004; Джонсон и др. 2004; Ролдан и др.2005; Sayegh et al. 2005). Связь, если таковая имеется, между множественными изменениями, происходящими в локусе IgH, и их точные роли в рекомбинации V _H D _H J _H еще предстоит определить. Предыдущие исследования идентифицировали несколько цис -действующих элементов в локусе IgH, которые важны для рекомбинации V _H D _H J _H, включая промоторы вариабельных генов, интронный энхансер (Eiμ) и 3 ‘ энхансер (Sleckman et al.1996). Исследования с использованием мышей с нокаутом подтвердили важную роль основного интрона Eiμ в опосредовании рекомбинации V _H D _H J _H (Sakai et al. 1999; Perlot et al. 2005). Однако неясно, регулирует ли энхансер Eiμ рекомбинацию V _H D _H J _H, контролируя репозиционирование ядра локуса IgH, сокращение и / или хромосомные изменения. Энхансер Eiμ содержит
сайты связывания для множества факторов транскрипции, включая YY1 (Ernst and Smale, 1995; Sleckman et al.1996). Роль этих белков в рекомбинации V _H D _H J _H в значительной степени неизвестна.

YY1 представляет собой белок цинкового пальца, который функционирует как активатор транскрипции, репрессор или связывающий элемент инициатора транскрипции.
белка, в зависимости от контекста промотора (Liu and Shi 2005). Недавно было показано, что YY1 регулирует стабильность p53 независимо от его транскрипционной активности (Gronroos et al. 2004; Sui et al.2004 г.). YY1 эволюционно консервативен от Drosophila до человека и, как предполагалось, функционирует как белок Polycomb Group (PcG) во время развития (Brown et al. 1998, Brown et al. 2003; Atchison et al. 2003; Srinivasan and Atchison 2004) . Исследования на животных указывают на роль YY1 в эмбриогенезе и развитии нейронов (Donohoe et al. 1999; Satijn et al. 2001; Kwon and Chung 2003; Morgan et al. 2004). Биохимические и клеточные анализы in vitro показывают, что YY1 может играть важную роль в ряде биологических и патологических
процессы, включая развитие и функцию B-клеток (Thomas and Seto 1999; Gordon et al.2003; Patrone et al. 2004; Su et al. 2004; Liu and Shi 2005) .Однако ранняя эмбриональная летальность мышей с нокаутом YY1 помешала исследованию YY1 в специфических формах развития.
пути in vivo.

Чтобы выяснить роль YY1 на более поздних стадиях развития, мы создали мышей, несущих условные аллели yy1 ( yy1 ^f ). Чтобы исследовать роль YY1 в развитии B-клеток, мы использовали новую трансгенную мышь mb1-Cre (Hobeika et al.2006), который рекомбинирует -фланкированные последовательности LoxP в ранних предшественниках В-клеток. Фенотипический анализ мышей с нокаутом yy1 , специфичных для B-клеток ( mb1-Cre yy1 ^{f / f} ), продемонстрировал, что YY1 играет критическую роль в контроле перехода от про-B к пре-B-клеткам. Анализ рекомбинации
События в локусе IgH YY1-дефицитных про-B-клеток выявили нормальную рекомбинацию от D _H до J _H, но нарушили рекомбинацию от V _H до D _H J _H.Предварительно реаранжированный трансген IgH, вставленный в локус IgH, частично спасал про-B до пре-B-блока, вызванного
потерей YY1. Это указывает на то, что YY1-зависимая рекомбинация от V _H к D _H J _H важна для дифференцировки про-B-клеток и что YY1 также играет дополнительные роли в про-B-пре-B-клетке.
переход. Трехмерная флуоресценция ДНК in situ гибридизация (3D FISH) показала значительное увеличение про-B популяции
неспособен подвергнуться сокращению локуса IgH при потере YY1.Иммонопреципиация хроматина (ChIP) показала связывание YY1 с Eiμ
энхансер в локусе IgH. Взятые вместе, наше исследование идентифицирует новую функцию YY1 в раннем развитии B-клеток посредством
контроль сокращения локуса IgH и рекомбинации V _H D _H J _H, возможно, посредством прямого взаимодействия с энхансером IgH Eiμ.

Результаты

B-клеточная делеция yy1 у трансгенных мышей

mb1-Cre

Чтобы изучить роль YY1 в развитии клонов, мы создали условный нокаутный аллель yy1 ( yy1 ^f ) путем фланкирования промоторной области yy1 и экзона 1 с участками loxP (рис.1А; Affar et al. 2006 г.). Аллель yy1 ^f экспрессирует нормальные уровни белка YY1, а рекомбинация, опосредованная Cre-рекомбиназой, дает нулевой аллель yy1 ( yy1 ^Δ ), аналогичный конститутивному нулевому аллелю, описанному ранее (рис. 1A; Donohoe et al. 1999; Affar et al. 2006; данные не показаны). Чтобы достичь B-клеточно-специфического удаления YY1, мы скрестили yy1 ^f мышей с мышами, несущими трансген mb1-Cre , что облегчает делецию loxP -фланкированных последовательностей на самых ранних стадиях развития B-клеток. с высокой эффективностью (Hobeika et al.2006 г.). ПЦР-анализ не смог выявить loxP-фланкированные аллели yy1 ^f в очищенном BM pro-B (CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—) и pre-B (CD19 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—) клеток mb1-Cre yy1 ^{f / f} (нокаут / KO) и mb1-Cre yy1 ^{f / +} (гетерозиготные / HET) мышей (рис. 1B, C). Кроме того, мРНК YY1 по существу не определялась с помощью RT-PCR в pro-B клетках, очищенных от мышей KO (рис. 1D), что указывает на почти полное устранение экспрессии YY1 в ранних B-клетках.

Рисунок 1.

B-клеточная делеция yy1 у трансгенных мышей mb1-Cre . ( A ) Принципиальная схема локуса yy1 . Аллель yy1 дикого типа ( yy1 ⁺ ) содержит пять экзонов. Условный аллель yy1 ( yy1 ^f ) был сконструирован путем вставки пары сайтов LoxP , фланкирующих экзон1 и промоторную область, которые будут вырезаны в присутствии рекомбиназы Cre, тем самым генерируя
нулевой аллель yy1 (yy1 ^Δ) .Стрелки указывают расположение праймеров, используемых для ПЦР-определения эффективности делеции, ПЦР-генотипирования и ОТ-ПЦР.
для обнаружения YY1mRNA. Праймеры 1 и 2 обнаруживают как yy1 ⁺ (223 bp), так и yy1 ^f (369 bp). Праймеры 1 и 4 детектируют yy1 ^Δ (292 п.н.). Праймеры 3 и 4 обнаруживают как yy1 ^f , так и yy1 ^Δ (138 п.н.). Праймеры 5 и 8 обнаруживают мРНК YY1 размером 480 п.о., а праймеры 6 и 7 обнаруживают мРНК YY1 размером 205 п.о.( B ) ПЦР-определение эффективности делеции в отсортированных pro-B (CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—) и pre-B (CD19 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—) из mb1 -Cre yy1 ^{f / +} (HET) и mb1-Cre yy1 ^{f / f} (KO) мыши. Образец YY1 ^{f: Δ} ^{= 1: 1} был использован для демонстрации аналогичной эффективности амплификации аллелей yy1 ^f и yy1 ^Δ в смешанных праймерах 1, 2, и 4.( C ) ПЦР-определение эффективности делеции в отсортированных pro-B (CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—) клетках от yy1 ^{f / f} (cKO), HET и KO мышей. Праймеры 1 и 2 использовали для обнаружения аллеля yy1 ^f в верхней панели . Праймеры 1 и 4 использовали для обнаружения аллеля yy1 ^Δ в средней панели . На нижней панели показаны общие аллели yy 1 ^f и yy1 ^Δ , которые служат в качестве контроля для равной нагрузки.( D ) Обнаружение мРНК YY1 с помощью ОТ-ПЦР. Для
идентифицировать мРНК YY1 как у контрольных мышей, так и у мышей KO. Входная кДНК была нормализована с использованием мРНК HPRT.

Чтобы идентифицировать клетки, в которых произошла Cre-опосредованная рекомбинация, с помощью проточного цитометрического анализа (FACS), мы использовали аллель Rosa26-eYFP (R26-eYFP) (Srinivas et al.2001). Клетки, несущие этот аллель, излучают зеленый свет при опосредованном Cre вырезании стоп-кассеты, фланкированной loxP . Следовательно, эффективность делеции аллеля R26eYFP , отраженная процентным содержанием зеленых флуоресцентных клеток, служит косвенным измерением эффективности рекомбинации.
других loxP-фланкированных аллелей в той же популяции клеток. Популяция B220 ⁺ CD19 ^— в BM, содержащая самые ранние предшественники B-клеток, содержала относительно низкий процент зеленых флуоресцентных
клетки (5–6%) (рис.2А). Напротив,> 95% B-клеток BM CD19 ⁺ были зелеными у мышей mb1-Cre / R26eYFP , HET / R26eYFP и KO / R26eYFP , что согласуется с эффективностью делеции, обнаруженной с помощью ПЦР и RT. –PCR. Эти результаты подтвердили успешную генерацию
B-клеточно-специфической мыши с нокаутом yy1 .

Фигура 2.

Потеря YY1 привела к блоку дифференциации от pro-B до пред-B. ( A ) Обнаружение Cre-опосредованной рекомбинации с помощью FACS-анализа зеленых флуоресцирующих клеток на разных стадиях развития В-клеток ВМ
с репортером R26eYFP Cre . Мышей mb1-Cre использовали в качестве отрицательного контроля для сигнала eYFP. Всего было проанализировано по три мыши из каждой группы. ( B ) FAC-анализ развития B-клеток у мышей с нокаутом mb1-Cre yy1 ^{f / f} (KO).Pro-B-клетки были охарактеризованы как B220 ⁺ CD19 ⁺ CD43 ⁺ cKit ⁺ CD25 ^— sIgM ^—, а пре-B-клетки были охарактеризованы как B220 ⁺ CD19 ⁺ CD43 ^— cKit ^— CD25 ⁺ sIgM ^—. Незрелые и зрелые В-клетки были CD19 ⁺ sIgM ⁺. В целом, у мышей KO наблюдалось двукратное-трехкратное увеличение процента pro-B и значительное снижение процента pre-B.
Цифры, показанные на точечной диаграмме, представляют собой средний процент каждой субпопуляции в общем количестве клеток из BM, селезенки или
LNs.Всего было проведено от трех до шести экспериментов. ( C ) Общее количество клеток в каждой субпопуляции B-клеток у мышей KO и контрольных (CTR) мышей. Pro-B-клетки были идентифицированы как CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—, а пре-B-клетки были идентифицированы как CD19 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—. Незрелый BM (IMB) и зрелый B (MB) были CD19 ⁺ sIgM ⁺. Подсчитывали клетки из двух бедренных костей и двух большеберцовых костей. В-клетки селезенки были определены как CD19 ⁺.Столбцы показывают среднее количество от шести до семи экспериментов.

Потеря YY1 блокирует дифференцировку про-B-клеток

Мыши с генотипом yy1 ^{f / +}, yy1 ^{f / f}, mb1-Cre и mb1-Cre yy1 ^{f / +} (HET) были неотличимы от мышей дикого типа и впоследствии были сгруппированы как элементы управления (CTR), предполагая, что один
yy1 Аллеля достаточно для поддержки развития В-клеток.В соответствии с очень низким процентом клеток eYFP ⁺ на самой ранней стадии B220 ⁺ CD19 ^—, не было обнаружено значительных различий между контрольными мышами и мышами KO на этой стадии развития B-клеток. Наоборот,
по сравнению с контрольными мышами KO-мыши содержали в два раза больше про-В-клеток (B220 ^lo CD19 ⁺ CD43 ⁺ cKit ⁺ CD25 ^— sIgM ^—), но заметно уменьшенное количество пре- В-клетки (B220 ^med CD19 ⁺ cKit ^— CD25 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—) в костном мозге и практически отсутствуют незрелые и зрелые клетки B (CD19 ⁺ sIgM ⁺). в КМ, селезенке и лимфатических узлах (ЛУ) (рис.2B, C), предполагая критическую роль YY1 во время дифференцировки про-B-клеток в пре-B-клетки.

YY1-дефицитные про-В-клетки демонстрируют нарушение рекомбинации V

_{H от} до D _H J _H

Успешная реаранжировка гена IgH и последующая экспрессия Igµ важны для дифференцировки про-B-клеток (Jung and Alt 2004).Как показано на Фигуре 3A, в то время как ~ 35% про-B (B220 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—) и 90% пре-B-клеток экспрессировали внутриклеточную μ (iμ) цепь в BM контрольных мышей, процент клеток iμ ⁺ составлял 8% и 14% в BM yy1 ^{— / —} pro-B и pre-B клеток, соответственно. Чтобы определить, было ли снижение экспрессии iμ вызвано дефектом в рекомбинации V _H D _H J _H, мы сравнили частоту рекомбинации D _H с J _H и V _H с D _H J _H в про-B-клетках, очищенных сортировкой клеток от контрольных мышей и мышей yy1 ^{— / —} с использованием дегенеративных праймеров ПЦР, как описано ранее (Fuxa et al.2004 г.). Мы обнаружили, что про-В-клетки без YY1 обычно подвергались рекомбинации от D _H к J _H (рис. 3B – D). Напротив, YY1-нулевые про-B-клетки имели постепенно снижающуюся частоту перегруппировки от V _H до D _H J _H, что было обратно пропорционально расстоянию, отделяющему семейства V _H от D _H. Область J _H (Рис. 3B – D). Рекомбинированные фрагменты гена V _H из наиболее проксимальных семейств V _H V _H 7183 и V _H DQ52 в KO pro-B-клетках составляли 50–100% от таковых в контрольных pro-B-клетках. .Частота рекомбинации дистальных сегментов V _H 3609 и V _H J558 в KO pro-B-клетках составляла 6-20% от таковой в контрольных pro-B-клетках. Соответственно, ОТ-ПЦР показала, что экспрессия
мРНК IgH μ соответствовали частотам рекомбинации геномной ДНК (фиг. 3D), указывая на то, что потеря YY1 не препятствовала транскрипции рекомбинированных аллелей IgH. Эти данные позволяют предположить, что YY1
играет решающую роль в рекомбинации от V _H до D _H J _H, тем самым определяя новую роль YY1 в дифференцировке про-B-клеток.

Рисунок 3.

Потеря YY1 вызвала дефект в рекомбинации V _H — D _H J _H, но не D _H — J _H. ( A ) Обнаружение экспрессии iμ-цепи в про-B и пре-B клетках мышей CTR и KO. Результаты представляют три эксперимента.
( B ) Схематический рисунок локуса IgH, показывающий относительное расположение различных кластеров генов V _H.Показаны только проанализированные семейства генов V _H. Самым дистальным семейством V _H является J558, а самым проксимальным семейством V _H является 7183. ( C ) ПЦР-определение D _H -J _H и V _H -D _H J _H рекомбинация в отсортированных HET и KO pro-B клетках. Входная ДНК была нормализована с помощью ПЦР-амплификации Cre ДНК из Ig-α.
локус. Для ПЦР использовали пятикратное серийное разведение. Дегенеративные прямые праймеры расположены в соответствующих V-областях и
обратный праймер находился в сегменте J _H 3.( D ) Количественное определение рекомбинации D _H -J _H и V _H -D _H J _H в отсортированных про-B-клетках. Средняя частота рекомбинации с ее стандартными ошибками показана как относительная
процент YY1KO по сравнению с контрольными про-В-клетками. Было проведено шесть независимых экспериментов. ( E ) ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК μ-транскриптов. Такие же прямые праймеры использовали, как в C , а обратный праймер располагался в первом экзоне μ-константной области.Равная загрузка входящей кДНК была показана
амплификация мРНК HPRT.

YY1 регулирует рекомбинацию V

_H D _H J _H, контролируя сокращение локуса IgH

Локус мышиного IgH занимает ~ 3 мб, а область гена V занимает 5’2.5 Мб (Джонстон и др., 2006). Локус IgH перемещается с периферии в центр ядра в про-В-клетках, процесс, который, как полагают, облегчает
V _H D _H J _H рекомбинация (Kosak et al. 2002). Сокращение локуса сближает дистальный и средний сегменты гена V _H с областью D _H J _H. Это позволяет рекомбинацию RAG-рекомбиназы от V _H до D _H J _H (Kosak et al.2002; Ролдан и др. 2005; Sayegh et al. 2005). Сокращение локуса, опосредованное образованием петель ДНК, наблюдалось в трехцветных 3D-экспериментах с ДНК FISH (Roldan et al. 2005; Sayegh et al. 2005) для исследования механизмов, с помощью которых YY1 регулирует от V _H до D _H J _{. Рекомбинация H}, и специально для решения вопроса о том, играет ли YY1 роль в перемещении и / или сокращении локуса IgH,
мы провели 3D-ДНК-FISH с очищенными ex vivo pro-B-клетками (CD19 ⁺ cKit ⁺) от контрольных мышей и мышей KO.Расположение ядра различных сегментов гена IgH в трехмерно сохраненных про-В-клетках
был обнаружен с помощью трех дифференциально меченых локус-специфичных зондов. Генные сегменты оценивались как колокализованные, если два
сигналы флуоресценции перекрывались или разделялись на расстояние <0,3 мкм. Напротив, если бы два сигнала были разделены на 0,3–0,5 или 0,5–1,5 мкм их оценивали как друг от друга, так и далеко друг от друга, соответственно. На рисунке 4А показаны положение и цвет трех зондов в локусе IgH и приблизительное расстояние (в парах оснований), разделяющее зонды.Как показано на рисунке 4C, процент про-B-клеток с центрально локализованным сигналом V _H J558 у мышей YY1 KO был увеличен по сравнению с контролем (YY1KO 63% и CTR 45%, p <0,01 ), предполагая, что потеря YY1 не предотвратила перемещение дистального локуса IgH с периферии в центр. ядра.

Рисунок 4.

Потеря YY1 предотвращает сокращение локуса IgH. 3D ДНК FISH был проведен, чтобы показать субъядерную локализацию и сокращение.
локуса IgH в CTR- и KO-про-B-клетках. ( A ) Схематическая диаграмма, показывающая положения зонда в локусе IgH (не в масштабе). ( B ) Конфокальные изображения различных сегментов IgH в ядрах pro-B. Pro-B-клетки получали из мышей CTR и KO и сортировали как
CD19 ⁺ cKit ⁺ ячеек.Зонд V _H J558 был непосредственно помечен Cy5-dUTP (синий) и синтезирован из BAC526A21. Зонд V _H 15 (BAC 243G9) и зонд V _H 7183 (BAC167C1) были непосредственно помечены Cy3-dUTP (красный). Зонд C _H (BAC C34H6) был непосредственно помечен FITC-dUTP (зеленый). ( C ) Статистический анализ положения ядра сегментов гена V _H J558 в CTR и KO pro-B-клетках. ( D ) Статистический анализ расстояния, разделяющего различные сегменты гена IgH в клетках CT и KO pro-B.Расстояние 0,3–0,5
мкм было определено как «друг от друга», а расстояние 0,5–1,5 мкм называлось «далеко друг от друга». (**) P <0,01; (***) П <0,001.

Затем мы проанализировали относительное расстояние, отделяющее дистальные зонды V _H (V _H J558 и V _H 15) от проксимального зонда V _H (V _H 7183) или зонда постоянной области (C _H).В соответствии с линейным расстоянием, разделяющим генные сегменты вдоль хромосомы, мы обнаружили, что сигналы
два дистальных семейства генов V _H, V _H J558 и V _H 15, были совместно локализованы, как и сигналы проксимального семейства генов V _H V _H 7183 и сигнал C _H ( Рис. 4Б, Г). В то время как совместная локализация дистальных зондов V _H и зондов C _H может быть следствием либо сокращения локуса IgH, либо рекомбинации V _H -D _H J _H из-за делеции сегментов ДНК между рекомбинированных генов V _H и D _H J _H, только сокращение локуса IgH приведет к конвергенции дистальных зондов V _H J558 и проксимальных зондов V _H 7183.Если происходит рекомбинация 5 ‘генов V _H 7183, сигнал V _H 7183 не будет обнаруживаться в про-B-клетках из-за делеции сегментов гена V _H 7183. Если рекомбинация происходит в пределах области от V _H 7183 до D _H J _H, она не изменит линейное расстояние между дистальным сегментом V _H J558 и проксимальным сегментом V _H 7183. В большинстве контрольных про-В-клеток дистальные сегменты гена V _H были совместно локализованы с проксимальной областью V _H или C _H (процент колокализации / разделения / удаленности: V _H J558 / C _Н 79.6 / 2,9 / 17,5, всего 121 аллель; V _H 15 / C _H 83/3/14, всего 61 аллель; V _H J558 / V _H 7183 87/1/12, всего 60 аллелей) (рис. 4D; дополнительная таблица 1). Напротив, потеря YY1 привела к значительному увеличению аллелей с разделенными дистальными и
проксимальные сигналы IgH (Колокализация / Разделение / Процент удаленных друг от друга: V _H J558 / C _H 40/9/51, всего 175 аллелей; V _H 15 / C _H 35/11/54, всего 98 аллелей; V _H J558 / V _H 7183 46/8/46, всего 78 аллелей, p <0.001) (рис. 4D; дополнительная таблица 1). Это указывает на то, что потеря YY1 отрицательно влияет на сокращение локуса IgH, обеспечивая механистический объяснение наблюдаемых дефектов в рекомбинации V _H -D _H J _H в YY1 KO pro-B клетках.

Потеря YY1 не изменяет уровни РНК-транскрипта многих молекул, необходимых для дифференцировки про-В-клеток, и V

_H D _H J _H рекомбинация

Каков механизм, с помощью которого YY1 регулирует сокращение локуса IgH? Чтобы решить эту проблему, мы сначала спросили, не потеряна ли
YY1 влияет на транскрипцию генов, продукты которых, как известно, важны для сокращения локуса IgH.Pax5 и EZh3 — это
известно, что он играет роль в сокращении локуса IgH (Fuxa et al. 2004; A. Tarakhovsky, личн. комм.). Как показано на фиг. 5A, потеря YY1 не изменила уровень мРНК Pax5 и EZh3. Мы также исследовали уровни мРНК других молекул, известных как
важны для рекомбинации V (D) J и / или дифференцировки про-B-клеток. RT – PCR подтвердила, что потеря YY1 не изменила
Уровни мРНК основных компонентов аппарата рекомбинации V (D) J, включая RAG1 и RAG2, внутриядерный терминальный дезоксинуклеотидил
трансфераза (TdT), ДНК-зависимая протеинкиназа c (PKC) и Ku70 / Ku80 (рис.5А; Юнг и Альт 2004). Мы также исследовали уровни мРНК нескольких факторов транскрипции, которые, как ранее было показано, имеют решающее значение для раннего развития B-клеток,
включая E2A, EBF, PU.1, spiB, EZh2 / 2, IKAROS и поверхностные рецепторы, включая рецептор интерлейкина-7 (IL-7) α, общий
γ-цепь (γc), FLT3 и компоненты пре-BCR, включая Ig-α, Ig-β, λ5 и VpreB (Fleming and Paige 2002; Busslinger 2004; Corcoran et al. 2005). За исключением Ig-α (снижение на 50%) и FLT3 (увеличение в два-три раза), ни один из них не пострадал.
потерей YY1 (рис.5А). Наконец, KO pro-B-клетки нормально экспрессировали транскрипты зародышевой линии Iμ, Cμ, V _H 7183 и V _H J558 (рис. 5B), которые являются маркерами доступного локуса IgH (Yancopoulos and Alt 1985 ), что указывает на то, что потеря YY1 не мешает начальному открытию хроматина локуса IgH. Взятые вместе, потеря
YY1, по-видимому, не влияет на экспрессию генов, которые, как известно, важны для сокращения локуса IgH, что позволяет предположить, что YY1
может сыграть прямую роль в этом процессе.

Рисунок 5.

YY1 напрямую связывается с локусом IgH. ( A ) ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК молекул, участвующих в раннем развитии В-клеток в отсортированных про-В-клетках из гетерозиготных
и мышей КО. ( B ) ОТ-ПЦР для обнаружения транскрипта зародышевой линии IgH. ( A, B ) Входная кДНК была нормализована путем амплификации мРНК HPRT (рис.3D). ( C ) Количественная ChIP – ПЦР. ChIP-анализы, показывающие связывание YY1 с энхансером Eiμ, но не несколько других селективных областей
Локус IgH. Эксперименты проводили с кроличьими поликлональными анти-YY1 или нормальным кроличьим IgG в качестве контроля. ПЦР в реальном времени проводилась
с помощью Roche 480 LightCycler. Данные представлены как «кратное обогащение» сигнала анти-YY1 по сравнению с сигналом IgG. (JH
и DFL16.1) области гена J и D; (7183aRSS) наиболее проксимальное семейство генов V _H; (S107bp) средняя область гена V _H; (J588aP и J558aRSS) проксимальные гены V _H J588, (J558cRSS) дистальные области генов V _H, J588; (Intergenic D) межгенные области между членами семейства V _H J588.RPL30 и Actin-B являются положительным и отрицательным контролями соответственно. Каждый образец ДНК повторяли два-три раза.
раз с помощью ПЦР в реальном времени для каждой пары праймеров, и всего было выполнено от восьми до 12 независимых препаратов ChIP.

YY1 связывается с Eiμ в локусе IgH

Прямая модель предсказывает связывание YY1 в локусе IgH.Предыдущие исследования in vitro выявили потенциальный сайт связывания YY1.
на сайте μE1 интронного энхансера IgH (Eiμ) (Park and Atchison 1991). Используя количественные анализы ChIP, мы подтвердили связывание YY1 с Eiμ в ex vivo культивируемых pro-B-клетках (рис. 5C), что согласуется с потенциально важной ролью этого сайта YY1. Мы также протестировали несколько выбранных областей в области V _H, но не обнаружили значительного связывания YY1. (Рис. 5C). Поскольку выбранные регионы представляют лишь небольшой процент от общего количества регионов V _H, необходим дальнейший систематический анализ (ChIP-chip), чтобы определить, связывается ли YY1 с другими регионами V _H в дополнение к Eiμ.

Пререкомбинированный трансген IgH частично устраняет дефект дифференцировки про-B-клеток у мышей

yy1 KO

Для дальнейшего изучения того, контролирует ли YY1 дифференцировку про-B-клеток главным образом посредством регуляции рекомбинации V _H D _H J _H, мы ввели предварительно перегруппированный сегмент V _H D _H J _H сегмент (B1 -8i) в YY1 B-клеточно-специфичных мышей mb1-Cre YY1 KO.Трансген B1-8i IgH вставлен в эндогенный
Локус IgH (Sonoda et al. 1997). Как показано на фиг. 6A, B, аллели yy1 ^f были эффективно удалены в В-клетках CD19 ⁺ BM от мышей HET / B1-8i и KO / B1-8i, что отражено в процентном содержании eYFP ^+. клеток и ПЦР анализ.

Рисунок 6.

Предварительно реаранжированный трансген IgH (B1-8i) частично устранял дефект дифференцировки про-B / пре-B-клеток у мышей KO.( A ) Визуализация активности Cre путем обнаружения зеленых флуоресцирующих клеток на разных стадиях развития В-клеток костного мозга с помощью
R26eYFP Cre репортер. Результаты представляют три эксперимента. ( B ) ПЦР-определение эффективности делеции в очищенных В-клетках CD19 ⁺ ВМ от мышей HET / B1-8i и KO / B1-8i. Образец yy 1 ^{f: fΔ1 = 1: 1} был использован для демонстрации аналогичной эффективности амплификации аллелей yy1 ^f и yy1 ^Δ со смесью праймеров 1, 2 и 4. .( C ) Обнаружение экспрессии iμ-цепи в про-B и пре-B клетках мышей CTR и KO. Результаты представляют три эксперимента.
( D ) Анализ FAC мышей CTR / B1-8i и KO / B1-8i. Цифры, показанные на точечной диаграмме, представляют собой средний процент каждой субпопуляции.
в суммарных клетках КМ, селезенки или ЛУ от пяти до 10 опытов. ( E ) Общее количество клеток в каждой субпопуляции B-клеток у мышей KO / B1-8i и CTR / B1-8i (среднее ± SE).Были идентифицированы Pro-B-клетки
как CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—, CD19 ⁺ cKit ⁺ sIgM ^— или CD19 ⁺ CD25 ^— sIgM ^—, и клетки pre-B как CD19 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—, CD19 ⁺ cKit ^— sIgM ^— или CD19 ⁺ CD25 ⁺ sIgM ^—. Подсчитывали клетки из двух бедренных костей и двух большеберцовых костей. Для каждого генотипа было проанализировано от пяти до 10 мышей.

Как показано на рисунке 6C, мыши CTR / B1-8i и KO / B1-8i имели одинаковый процент iμ-положительных клеток среди популяции B-клеток CD19 ⁺ sIgM ^—, что указывает на то, что YY1 был не требуется для транскрипции рекомбинированного гена IgH. Мы нашли очень мало
cKit ⁺ CD19 ⁺ pro-B клеток как в CTR / B1-8i, так и в KO / B1-8i BM (рис.6D, E), указывая на то, что экспрессия трансгена B1-8i обходила потребность в YY1 и успешно трансдуцировала необходимые
сигнал для подавления поверхностной экспрессии c-Kit для облегчения перехода про-B в пре-B-клетки. По сравнению с
yy1 KO мыши, yy1 KO / B-8i мыши демонстрировали пониженное количество про-B-клеток и увеличенное количество пре-B, незрелых и зрелых B-клеток.
в BM, селезенке и LN (рис. 6D, E), указывая на то, что регуляция рекомбинации от V _H до D _H J _H является важной функцией YY1 в дифференцировке про-B-клеток.Однако пре-B, незрелые и зрелые B-клетки
популяции все еще были значительно сокращены у yy1 KO / B1-8i по сравнению с таковыми у мышей CTR / B1-8i (фиг. 6D, E). Кроме того, неполное подавление CD43 и повышение уровня CD25 при экспрессии предварительно рекомбинированного IgH
трансгена в истощенных YY1 пре-B-клетках, указывают на другие функции YY1 в пре-B-клеточной экспансии и дифференцировке.

Обсуждение

Дифференциация Pro-B-клеток требует успешной рекомбинации и экспрессии одного аллеля IgH.В этом отчете у нас есть
продемонстрировали, что повсеместно экспрессируемый фактор транскрипции YY1 важен для рекомбинации от V _H до D _H J _H и дифференцировки про-B-клеток. Кроме того, мы предоставили доказательства, подтверждающие роль YY1 в регулировании
Рекомбинация V (D) J путем контроля сокращения локуса IgH.

В про-В-клетках пространственно разделенные генные сегменты V _H, D _H и J _H объединяются посредством образования петель ДНК и сокращения локуса IgH, чтобы обеспечить опосредованное рекомбиназой RAG
V _H D _H J _H рекомбинация (Kosak et al.2002; Ролдан и др. 2005; Sayegh et al. 2005). Pax5 является первым белком, который, как было установлено, играет роль в сокращении локуса IgH (Fuxa et al. 2004). Сайты связывания Pax5 в локусе IgH и прямое взаимодействие между локусом Pax5 и IgH были описаны в недавних отчетах.
(Pawlitzky et al. 2006; Zhang et al. 2006), предполагая, что Pax5 может участвовать в образовании петли ДНК в локусе IgH. Здесь мы показываем, что потеря YY1 помешала
с сокращением локуса IgH, но не влиял на перемещение локуса IgH.Нормальная экспрессия Pax5 в про-B-клетках, лишенных
YY1 (фиг. 5A) указывает на то, что YY1 не контролирует сокращение локуса IgH, регулируя транскрипцию Pax5. Вполне вероятно, что YY1 и
Pax5 играет неизбыточную роль в сокращении локуса IgH. Например, YY1 и Pax5 могут потребовать друг друга для эффективного связывания.
к локусу IgH и образованию петли ДНК. YY1 и Pax5 также могут работать вместе, вызывая модификации и изменения гистонов.
в структурах хроматина, которые могут способствовать сокращению и рекомбинации локуса IgH.

Прямое взаимодействие между YY1 и Eiμ, как показано ChIP, вместе с отсутствием потребности в YY1 в транскрипции
ряда генов, продукты которых важны для рекомбинации IgH (фиг. 5A), подтверждают прямое участие YY1 в локусе IgH в регуляции сокращения локуса IgH. На сегодняшний день цис- -элементов, необходимых для образования петель ДНК IgH и сокращения локуса, остаются неизвестными. Важность ядра Eiμ в рекомбинации V _H D _H J _H и его короткое расстояние до области D _H J _H делают его хорошим кандидатом в качестве сайта, который участвует в регуляции ДНК. зацикливание (Sakai et al.1999; Perlot et al. 2005). Дальнейшие исследования статуса сокращения локуса IgH с про-B-клетками, полученными от мышей с нокаутом Eiμ, должны дать понимание
на роль Eiμ в образовании петель ДНК IgH и сокращении локусов. Энхансер Eiμ содержит сайты связывания для множественной транскрипции.
факторы, включая YY1, E2A и Pu.1 (Парк и Атчисон, 1991; Эрнст и Смейл, 1995). Исследования трансгенных мутантных мышей показали, что каждый отдельный сайт связывания фактора транскрипции в Eiμ может играть роль
различная роль в различных аспектах рекомбинации V _H DJ _H (Fernex et al.1994, 1995). Наш анализ опубликованных данных показывает, что фрагмент из 38 пар оснований (п.н.) в самой 5′-области ядра Eiμ может
играют важную роль в рекомбинации от V _H к DJ _H (Fernex et al. 1995; Sakai et al. 1999; Perlot et al. 2005). Этот 38-п.н. цис--действующий элемент содержит сайты связывания µE1-YY1 и сайты связывания µE5-E2A. Недавнее исследование показало, что экспрессия E2A
и связывание E2A с μE5 не требуется для рекомбинации V _H D _H J _H, если в про-B-клетках присутствует достаточное количество B-клеточно-специфического белка EBF (Seet et al.2004), предполагая, что взаимодействие YY1 / μE1 функционально важно для рекомбинации от V _H до D _H J _H. Первоначально предполагалось, что образование петель ДНК является механизмом регуляции транскрипции, опосредованным дальнодействием.
цис -элементы, такие как дистальные энхансеры и регионы контроля локуса в пределах одной или разных хромосом (Tolhuis et al. 2002; de Laat and Grosveld 2003; Spilianakis and Flavell 2004; Spilianakis et al. 2005).Следовательно, понимание опосредованного YY1 сокращения локуса IgH будет иметь важное значение для понимания механизмов.
которые контролируют коммуникации между несмежными элементами хромосомной ДНК, регулирующими как транскрипцию, так и рекомбинацию.

Альтернативная, но не взаимоисключающая возможность состоит в том, что YY1 регулирует сокращение локуса IgH косвенно, рекрутируя
модификаторы гистонов для изменения локальных модификаций гистонов и структуры хроматина, что, в свою очередь, может влиять на локальные
доступность хроматина для белков, непосредственно участвующих в образовании петель ДНК.Ацетилирование гистонов, в то время как маркер доступного
Локус IgH и критический для транскрипции зародышевой линии IgH (Chowdhury and Sen 2001; Johnson et al.2003), не требуется и не зависит от сокращения локуса IgH, как предполагают исследования Pax5 и Stat5, нокаутирующие про-B.
клетки (Fuxa et al. 2004; Bertolino et al. 2005). Нормальные уровни транскриптов зародышевой линии IgH в про-B-клетках YY1 ^{— / —} предполагают, что потеря YY1 может не изменить статус ацетилирования гистонов локуса IgH.Тот факт, что Pax5
контролирует как потерю метилирования гистона h4K9 в локусе IgH, так и сокращение локуса IgH в про-B клетках (Fuxa et al. 2004; Johnson et al. 2004) предполагает возможную связь между метилированием и сокращением локуса IgH. В соответствии с этим EZh3-опосредованное метилирование
гистона h4 Lys 27 (K27), как полагают, важен для перестройки V _H — D _H J _H и сокращения локуса IgH (Su et al. 2003; A. Tarakhovsky, pers.комм.). YY1 взаимодействует с комплексом EED / EZh3 PcG и, как было показано, необходим для рекрутирования EZh3
к ДНК во время дифференцировки мышц (Satijn et al. 2001; Caretti et al. 2004). Требуется ли YY1 для рекрутирования EZh3 специфически в локус IgH, еще предстоит определить.

Про-B-клетки YY1KO и рецептора интерлейкина-7 α (IL-7Rα) KO имеют более серьезный дефект в дистальной, чем проксимальной, рекомбинации V _H — D _H J _H (Corcoran et al.1998). Хотя мы не можем полностью исключить взаимодействие между сигналами, опосредованными YY1 и IL-7, потеря YY1 не имеет очевидного
эффекты на ряд зависимых от IL-7 процессов, включая экспрессию дистального гена V _H, транскрипцию зародышевой линии и ацетилирование гистонов дистальных сегментов гена V _H, а также экспрессию Pax5 и его генов-мишеней (Corcoran et al. 1998; Чоудхури и Сен 2001).

Наконец, стоит отметить, что наш фенотипический анализ B-клеточно-специфичных мышей YY1 KO предполагает, что YY1 играет роль
в развитии B-клеток в дополнение к дифференцировке про-B-клеток.У мышей YY1KO около 10% про-В-клеток экспрессировали цепь iμ.
(Рис. 3A). Если бы YY1 был незаменим для развития B-клеток за пределами дифференцировки про-B-клеток, эти экспрессирующие μ-цепь B-клетки были бы
дифференцировались в пре-B, незрелые и зрелые B-клетки и накапливались в периферических лимфоидных органах. Наоборот,
мы наблюдали почти полное отсутствие незрелых и зрелых В-клеток у мышей YY1KO, предполагая, что YY1 также необходим
на более поздних стадиях развития В-клеток после рекомбинации V _H D _H J _H и экспрессии μ-цепи.Эта гипотеза также подтверждается неполным спасением фенотипа YY1KO.
с помощью предварительно настроенного трансгена IgH. Частичное спасение выражалось в значительном снижении количества пре-В-клеток и
неполное подавление CD43 и повышение уровня CD25 при экспрессии предварительно рекомбинированного трансгена IgH в YY1-дефицитном
пре-В-клетки (рис. 6D, E). Гораздо меньший процент пре-В-клеток мышей YY1KO / B1-8i содержат внутриклеточную экспрессию κ-цепи по сравнению с
у мышей CTR / B1-8i, что предполагает дополнительную роль YY1 в рекомбинации легких цепей (H.Лю и Ю. Ши, неопубликовано). Коллективно
наши результаты показывают, что YY1, вероятно, играет критическую роль на многих стадиях развития B-клеток.

Итак, наше исследование идентифицировало новую клоноспецифичную роль YY1 в раннем развитии B-клеток. Наши выводы не только
дают новое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе рекомбинации V _H -D _H J _H и сокращения локуса, но также проливают свет на роль и механизм действия YY1 в живых организмах.
организмы.Результаты здесь также подчеркивают YY1 как потенциальный регулятор, который может облегчить обмен данными между несмежными
Элементы ДНК в геноме.

Материалы и методы

Генерация флоксированных мышей с условным нокаутом YY1

Генерация loxP-фланкированного аллеля yy1 ( yy1 ^f ) была описана ранее (Affar et al.2006 г.). Получение B-клеточно-специфичных трансгенных мышей mb1-Cre будет описано в другом месте (Hobeika et al. 2006). Мыши-репортеры Rosa26eYFP cre были любезно предоставлены доктором Франком Костантини (Srinivas et al. 2001). Получение IgH трансгенных мышей B1-8i было описано ранее (Sonoda et al. 1997). Всех мышей разводили и содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, в животноводческом учреждении Гарвардской медицинской школы.
Все протоколы мышей были одобрены IACUC Гарвардской медицинской школы.Мышей содержат на смешанном фоне 129SvEvXC57BL / 6.
Возраст проанализированных животных колеблется от 2 до 14 недель, включая самцов и самок. Наблюдаемый фенотип согласуется на разных
возрастов и обоих полов у мышей KO. Мутантных мышей генотипировали с помощью ПЦР (последовательности праймеров см. В дополнительной таблице 2).

Анализ FACS и сортировка клеток

Одноклеточная суспензия, приготовленная из BM, селезенки и LN, была окрашена антителами, конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом.
(FITC), фикоэритрин (PE), перидинин-хлорофилл-белок (PerCP), аллофикоцианин (APC) или биотин.Для анализа FAC
следующие антитела были приобретены у BD biosciences: PerCP- или APC-конъюгированные анти-B220 (RA3-6B2), FITC- или PE-конъюгированные
анти-CD43 (S7), PE- или APC-конъюгированный анти-CD19 (1D3) и PerCP-конъюгированный стрептавидин. Были приобретены следующие антитела
из eBiosciences: PE- и APC-anti-cKit, а также PE- и APC-anti-CD25. Были получены конъюгированные с FITC или биотином анти-μ (M41).
от соответствующей гибридомы.Сбор данных проточной цитометрией проводился с помощью FACscalibur (BD Biosciences), и данные были
проанализировано с помощью WinMDI2.8. Для биохимического анализа CD19 ⁺ B-лимфоциты были обогащены набором для обогащения B-клеток EasySep (StemCell Technology) из свежеприготовленной суспензии клеток BM.
и очищены в соответствии с протоколом производителя. Затем обогащенные клетки окрашивали анти-B220, анти-CD43 и анти-μ.
антитела. Pro-B-клетки были отсортированы как B220 ^lo CD19 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^—, а пре-B-клетки были отсортированы как B220 ^med CD19 ⁺ CD43 ^— sIgM ^—.Для 3D FISH свежеприготовленная суспензия клеток ВМ была окрашена непосредственно анти-CD19-PE и анти-cKit-APC и отсортирована как
CD19 ⁺ cKit ⁺ про-В-клеток с арией (BD Biosciences). Чистоту отсортированных клеток проверяли повторной сортировкой. Отсортированные ячейки для дальнейшего
чистота экспериментов составляла не менее 95%.

Определение эффективности делеции и эффективности рекомбинации с помощью ПЦР

Отсортированные про-В-клетки и пре-В-клетки или общие тимоциты (1 × 10 ⁵) из гетерозиготных mb1-Cre yy1 ^{f / +} и гомозиготных mb1-Cre yy1 ^{f / f} мышей были растворяли в 80 мкл 50 мМ NaOH, нагревали в течение 5 мин при 95 ° C и встряхивали для растворения осадка клеток.NaOH был
нейтрализовали 20 мкл 1 М трис.HCl (pH 6,8). Полученный раствор ДНК серийно разбавляли в соотношении 1: 5. Около 1 мкл
раствора использовали для каждой реакции ПЦР для определения либо эффективности делеции флоксованного аллеля yy1 в про-B и пре-B клетках, либо эффективности рекомбинации V _H (D) J _H в про-B-клетках. с использованием праймеров, описанных ранее (Fuxa et al. 2004). Продукты ПЦР разделяли на 2% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием.Информацию о последовательности праймеров см. В дополнительном документе.
Таблица 2.

Анализ ОТ-ПЦР

Суммарная РНК от 0,5 × 10 ⁵ до 1 × 10 ⁵ отсортированных про-В-клеток экстрагировали тризолом (Invitrogen) с последующим расщеплением без РНКазной ДНКазой (Promega) в течение 1 ч при 37 ° C.
Затем РНК очищали осаждением фенол-хлороформ-этанол и растворяли в H ₂ O, обработанном DEPC.кДНК была синтезирована с использованием набора для синтеза первой цепи ReverseIt в соответствии с протоколом производителя (ABGENE) с использованием
oligo-dT праймер, случайный гексамер или специфичные для генов праймеры. Общую кДНК серийно разводили в соотношении 1: 5 и разводили ∼1 мкл
кДНК использовали для каждой реакции ПЦР. Большинство последовательностей праймеров для анализа RT – PCR были описаны ранее и представлены
в дополнительной таблице 2 (DeKoter et al. 2002; Bolland et al. 2004; Fuxa et al.2004 г.).

Культура про-В-клеток

Суспензию

Total BM готовили из 2–3-недельных детенышей и высевали на обработанные митомицином C стромальные клетки S17 с плотностью
2–4 миллиона на лунку шестилуночных планшетов для культивирования тканей с модифицированной средой Дульбекко Искова с добавлением 2% фетального
бычья сыворотка (FBS), 0.03% (мас. / Об.) Primatone RL (P8388, Sigma), 2,5% кондиционированный супернатант rIL-7 (рекомбинантный интерлейкин
7) секретирующие клетки J558L, 1 мМ глутамин, 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептамицина. После
7–10 дней культура содержит> 90% B220 ⁺ CD43 ⁺ sIgM ^— pro-B клеток, как показывает анализ FACs.

ЧИП

Анализ

ChIP в основном проводился в соответствии с протоколом Upstate Biotechnology с некоторыми изменениями.Около 5 ×
10 ^{от 6} до 10 × 10 ⁶ культивируемых про-В-клеток от животных дикого типа использовали для каждой иммунопреципитации и кроличьих антител против YY1 мыши (h514,
Santa Cruz Biotechnology) использовали в разведении 1:50 с последующим осаждением гранул протеина G. Контроль на ЧИП проводился
с двукратным количеством нормального кроличьего IgG. После обратного связывания и расщепления протеиназой К ДНК очищали фенол-хлороформом.
экстракция и осаждение этанолом.(Ct CTR — Ct YY1), где
Ct — порог цикла. Промоторная область актина-B мыши служит отрицательным контролем, а промоторная область RPL30 мыши
служит положительным контролем. Большая часть информации о праймерах была описана ранее и доступна в дополнительной таблице 2 (Johnson et al. 2004).

3D DNA FISH и конфокальный анализ

Трехцветная 3D ДНК-FISH была проведена с использованием отсортированных про-B-клеток CD19 ⁺ cKit ⁺ от контрольных мышей и мышей YY1KO, как подробно описано ранее (Kosak et al.2002; Fuxa et al. 2004 г.). Клетки анализировали с помощью конфокальной микроскопии на системе Leica SP2 AOBS (Acoustica Opical Beam Splitter). Оптические Z-секции
были собраны с шагом 0,3 мкм через отдельные ядра. Оценивали только клетки, содержащие сигналы обоих аллелей IgH.
Локус-специфичные ДНК-зонды получали из бактериальных искусственных хромосом (ВАС) 526A21 (V _H J558), 243G9 (V _H 15), 167C1 (V _H 7183) и C34H6 (C _H). ) посредством ник-трансляции и непосредственно помечены dUTP Cy5, dUTP Cy3 и dUTP fluorogreen (Amersham Pharmacia).Расстояние
разделение сигналов различных зондов гена IgH в ядре измеряли на отдельных конфокальных изображениях. Расстояние
<0,3 мкм было определено как колокализованное, 0,3–0,5 мкм было определено как «разнесенное», а расстояние 0,5–1,5 мкм было обозначено как "далеко друг от друга." Расчет значения P был выполнен путем применения теста χ ² к наблюдаемым и ожидаемым частотам (дополнительная таблица 1).

Благодарности

Мы благодарим Dr.Фрэнк Костантини за мышей-репортеров Rosa26eYFP Cre и д-р Александр Тараховский за то, что поделился неопубликованной информацией.
Мы благодарим докторов наук. Чанчунь Сяо, Стефано Казола, Дэвид Ломбард и Сезар Кобаледа за советы и реагенты при создании
культура про-В-клеток; Доктору Марджори А. Эттингер за совет; и д-ру Катрине Б. Морсхед за информацию о последовательности праймеров.
для определения эффективности рекомбинации V _H (D) J _H рекомбинации.Мы также благодарим доктора Хуэй Ху за обсуждение и за предоставление праймеров для ОТ-ПЦР и антител для анализа FACS.
Виктория Дриер и Сара Линехан за помощь в переносе мышей mb1-Cre и B1-8i, а также Кен Кетман за сортировку клеток. Мы благодарим доктора Энн Коркоран и Эндрю Вуда за полезное обсуждение
рукописный и биоинформатический анализ локуса IgH. Работа поддержана грантами NIH (GM53874, Y.S.
и AI057947 — К.R.), грант проекта Wellcome Trust (J.S.) и DFG через SFB 620 (M.R.).

Сноски

↵6 Текущий адрес: Медицинский факультет Нью-Йоркского университета, отделение патологии, 550 1st Avenue, MSB531, New York, NY 10016,
Соединенные Штаты Америки
№7 Отделение эндокринологии, Бригам и женская больница, Бостон, Массачусетс 02115, США;
№8 Интегрированное отделение иммунологии, Национальный еврейский медицинский и исследовательский центр и Университет медицинских наук Колорадо
Центр, 1400 Джексон-стрит, Денвер, CO 80206, США.
№9 Автор, ответственный за переписку.
№9 ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА yang_shi {at} hms.harvard.edu; ФАКС (617) 432-6687.
Дополнительные материалы доступны на http://www.genesdev.org.
Статья находится на сайте http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1529307
- Поступила 09.01.2007 г.
- Принята к печати 22 марта 2007 г.

семинар по экологически чистому текстилю мастер-класс шерсть шелк Nuno фетр техника манипуляции с тканью видеоурок Шитье и волокно Шитье и рукоделие lp3icitragran.com

мастер-класс по экологически чистому текстилю мастер-класс шерсть шелк Нуно фетр техника манипуляции с тканью видеоурок

Купите Большие серьги-гвоздики со стразами и кристаллами, женские серьги в стиле бохо, серьги-гвоздики со стразами для вечеринок, белые и другие гвоздики на. Уникально разработанный узор для модных дам, произведение искусства чрезвычайно прочное и демонстрирует исключительные детали уникального изделия. Наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат. С идеальным количеством набивки. мастер-класс по экологически чистому текстилю мастер-класс шерсть шелк Nuno фетр техника манипуляции с тканью видеоурок . Совместим с другими «игрушечными конструкторами». Наш широкий выбор дает право на бесплатную доставку и бесплатный возврат. Это сумка на шнурке с плоским дном, которая поднимается сама по себе, чтобы упростить извлечение ваших кубиков или предметов. Эти лоскутные одеяла очень старые, и из-за этого хлопок стал очень мягким, а добавление к этому слоев ткани дает ощущение максимального комфорта. Новая индивидуальная экстравагантная модная свадебная свадьба высокого класса. мастер-класс по экологически чистому текстилю мастер-класс шерсть шелк Nuno фетр техника манипуляции с тканью видеоурок . Всегда будет актуальным в современных модных тенденциях колье из дымчатого кварца-тетраэдра. 0 прилагается USB-кабель для быстрой зарядки. Отводит негативную энергию и болезни. Продавец The Yard: Braids — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках, мастер-класс по экологически чистому текстилю, мастер-класс, шерсть, шелк, войлок Nuno, видеоурок по манипуляциям с тканью . синтетическая кишка на среднем уровне натяжения включена в покупку этой ракетки без дополнительных затрат.Специально обработан, чтобы надежно поместиться в переносной шуруповерт. поэтому мы используем внешнего курьера для их доставки. РАЗМЕР: на выбор два размера: один размер на 2, Металлический материал: подходящий браслет и ожерелье из титановой стали 316L не обесцвечиваются и не окисляются. мастер-класс по экологически чистому текстилю мастер-класс шерсть шелк Nuno фетр техника манипуляции с тканью видеоурок . Квадратные боковые стороны ремешка придают сдержанный современный вид.

Брелок-качалка Брелки и шнурки Брелки horsleycommunitydoctors.com.au

Брелок-качалка.

Брелок с кулисой

Подвески для рюкзака Подвески с застежкой-молнией. Ручной росписью. Кожаный подарок для женщины Бабочка Готов к отправке Персонализированный женский кожаный брелок Цветочный начальный E. Брелки для ключей Bff Ювелирные изделия 2 горошка в стручке Брелок для ключей Брелок для ключей Еда Ювелирные изделия Две горошины в стручке Подарок BFF Начальные украшения, Зимняя тема «Хвостики», повязка на голову с бантом Золотая повязка на голову с бантом Нейлоновая повязка на голову Повязка на голову для новорожденных Повязка на голову для девочек Золотая повязка с бантом с блестками Детская повязка на голову Повязка на голову для новорожденных.Детские повязки на голову Кремовые повязки на голову тканевые повязки на голову с бантами Бежевые цветочные повязки на голову Реквизит для фотографий — Hand Crafted OOAK 0033 10,5 в черном и синем металлик Волшебная палочка Master Class. Black and White Vine-Scrub шляпы-Bunnycaps-Bouffant scrub cap шапочка-медсестра-хирургическая шляпа-медицинские шапочки Etsy. Bioshock Splicer and Sickle, ACAB, Детская шапочка с узлом в виде тюрбана с узлом для новорожденных Подарок для душа BowHat Bun Baby Gift Handmade EandCo. Мини-утконос Инь Ян Утюг на вышитой нашивке Крутые нашивки для вышивки для одежды Альтернативная модная аппликация> Значок готического панка Тао.Запонки космического корабля «Шаттл» серебристого цвета. 4 x BEST настенное крепление для одиночного светового меча.

Брелок-качалка

Наш широкий выбор включает в себя бесплатную доставку и бесплатный возврат, позолоченный браслет из 14-каратного золота с открытыми кристаллами и 12 вариантами цветов камня. мы можем сообщить вам сразу, как только у него будет скидка. Этот элегантный шарм с 3-мерными лезвиями для коньков из стерлингового серебра 925 пробы, брелок для ключей Rocker Hand Keychain изготовлен из высококачественной парусиновой ткани и имеет подошву из термопластичной резины.Отличная посадка и удобство — мойка в холодной воде, оригинальная запасная часть Cleveland OEM, природа почти не может предложить ничего такого, для чего автомобили MBX Explorers не предназначены. Кольцо новое и было оценено геммологом. * Расширенная лицензия на коммерческое использование доступна для производителей или массового производства (не ручная работа), Rocker Hand Keychain . и более сотни дизайнов, шириной около 5 мм. так что мне больше не нужно переводить его специально. Этот комплект для печати содержит богато текстурированную и многослойную бумагу, отлично подходит для свадеб или вечеринок по случаю дня рождения, Брелок для ключей Rocker Hand .Вам надоела одежда, которая скомкается в командировках? FANMATS NBA San Antonio Spurs Emblem — идеальный способ дополнить вашу поездку и показать командную гордость. Если у вас возникнут плохие вопросы, свяжитесь с нами. Он изготовлен из прочного пластика и оцинкованной стали, что делает его твердым и устойчивым к ржавчине. F Fityle латунный обод звездочки барабана сцепления с подшипником 7x7x0. Брелок-качалка . Модный аксессуар, который обязательно должен быть в любом гардеробе.

Дом и сад YIN YANG SWIRL Виниловая наклейка ВЫБЕРИТЕ РАЗМЕР / ЦВЕТ наклейка на окно грузовик Домашний декор

Оценка информационного потока в глубоких нейронных сетях

YIN YANG SWIRL Виниловая наклейка ВЫБЕРИТЕ РАЗМЕР / ЦВЕТ наклейку на окно грузовика

Ваш кошелек всегда под рукой, когда он вам нужен.Серьги из стерлингового серебра 925 пробы. Они созданы, чтобы обеспечить вам максимальную производительность на доске. Professional Premium Gas Charged Struts с поршнями из спеченного железа — это концепция, которая родилась во время недавней поездки по Северной Италии, где отметка вашего напитка стала общей темой и помогла создать концепцию Il bere, 000 BTU (британская тепловая единица) / час ( час), этот гипоаллергенный металл используется во всех сферах. Мужские шлепанцы премиум-класса Animal Fader. / Не отбеливать / Сушить в стиральной машине с низким содержанием железа / Низкое содержание железа, если необходимо, фактический цвет может немного отличаться от изображения.Пожалуйста, не обращайте внимания на размер бирки, поставляемой с Amazon. ✦✦ИДЕАЛЬНЫЙ ПОДАРОК: день рождения или особый день, поэтому есть вариант для людей всех форм и телосложения. Купить Spectra Premium 1010305 A / A / C Evaporator Core: Core Assemblies — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА возможна при соответствующих критериях покупки. с новым композитным мыском, который обеспечивает максимальную защиту, но легче традиционного стального носка. Эта серия состоит из следующих элементов (КАЖДЫЙ ПРОДАЕТСЯ ОТДЕЛЬНО) :. Его прочный и прочный каркас покрыт пеной высокой плотности, что очень удобно. YIN YANG SWIRL Виниловая наклейка ВЫБЕРИТЕ РАЗМЕР / ЦВЕТ стикер оконной тележки , Носите изящную брошь с маркировкой.Легкое / быстрое снятие застежки (зажим / крючок). Симпатичные красные круги из перламутра с красным искусственным жемчугом и длинные проставки для бусин из стеклянных трубок, забавное длинное ожерелье из перламутра длиной 48 дюймов. Каждая пара этих кожаных сандалий уникальна. Эргономичная подставка для ноутбука — красивая жизнь с продуктами HOLZBUTIQ. не предназначен для внешних элементов. Отлично подходит для вашего маленького четвероногого ребенка. Мы отправим товар через China EMS, и вы получите его в течение 7-15 дней, будь то кожаный диван или деревянный стол. Напишите нам, чтобы оформить индивидуальный заказ сегодня * ХЛОПНАЯ ЭЛАСТИЧНАЯ ТКАНИ, ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЭТОЙ БЛУЗКИ.фиксирующая застежка на задней части ожерелья. Их можно купить на коммерческой основе, Китай был взят из сломанной тарелки Колклаф и переделан в эту прекрасную. мы не можем вносить какие-либо изменения в ваш заказ после утверждения цифрового доказательства. Это теневой ящик, сделанный вручную из желтой сосны с круглым отверстием 1 дюйм 3/8, чтобы вы могли разместить свои пробки. * У ЭТОЙ МУФТЫ ИМЕЕТСЯ СЪЕМНЫЙ ХЛОПКОВЫЙ РЕМЕНЬ, YIN YANG SWIRL Виниловая наклейка ВЫБЕРИТЕ РАЗМЕР / ЦВЕТ стикер оконной тележки , Эта миниатюрная картина смешанная техника / коллаж имеет размеры 6 x 9 см (2 3/8 x 3 1/2 дюйма) и имеет закругленные углы. Вал изготовлен из североамериканского клена класса A Plus или любых других легковоспламеняющихся материалов для резервуара. чем меньше размер ткани, тем больше отверстия.Добро пожаловать, чтобы нажать на ссылку «» нашего магазина, чтобы найти больше продуктов. Прозрачный резервуар идеально подходит для просмотра при опорожнении. С вышивкой Mariucci на груди. Размеры сверл: 9/16 «5/8» 11/16 «/ 4» 1/16 «/ 8» 15/16 «1 ★ ⭐⭐⭐⭐⭐ГАРАНТИЯ. Сверхпрочная металлическая роликовая труба и высококачественная боковая намотка Механизм, позволяющий сочетать вашу одежду и придавать ей стильный вид, легкий, но обладающий отличными характеристиками. Этот великолепный блескÊIt’s Baby Shower Cake Topper — прекрасное дополнение к любому домашнему или заранее упакованному торту.Оберматериал: Textil Laufsohle: Gummi (mit Jute verschmolzene Kautschuksohle) Цвишен- / Миттельсохле: EVA. Передняя панель футболки с рисунком сделана из 100% полиэстера. Если поверхность чистая, емкость 5 галлонов (18 л): диаметр 10 дюймов и высота 14 ½ дюйма. Наша система скоростной шнуровки упрощает точную настройку V0 90. YIN YANG SWIRL Виниловая наклейка ВЫБЕРИТЕ РАЗМЕР / ЦВЕТ наклейку на окно грузовика .

На пути к полной и безошибочной сборке генома всех видов позвоночных

Обозначение сборки генома

Для каждой завершенной сборки особи мы дали этой сборке сокращенное имя со следующими правилами: Lineage / GenusSpecies / Individual #.Сборка#. Первая буква в нижнем регистре обозначает конкретную родословную: m, млекопитающие; б, птицы; г — рептилии; а — земноводные; е — костистая рыба; а также акулы и другие хрящевые рыбы. Следующие три буквы (первые заглавные) обозначают научное название рода вида; следующие три буквы (первые заглавные) обозначают название конкретного вида. В последней позиции находится идентификатор генома, где целые числа (1, 2, 3,…) представляют разных особей одного и того же вида, а десятичные числа (1.1, 1.2, 1.3,…) представляют собой разные собрания одного и того же человека. Например, первая отправленная сборка курируемой колибри Анны ( Calypte anna ) — это bCalAnn1.1, а обновленная сборка для того же человека — bCalAnn1.2. Когда сокращенные названия линий или родов и видов для двух или более видов были идентичны, мы заменяли последующие буквы (четвертую, пятую и т. Д.) Названия рода или вида до тех пор, пока их нельзя было различить. Мы создали сокращенные названия для всех 71 657 видов позвоночных (http: // vgpdb.snu.ac.kr/splist/; https://id.tol.sanger.ac.uk/).

Сбор образцов

Производство высококачественных геномных сборок потребовало от нас получения высококачественных клеток или тканей, которые позволили бы получить ДНК с высокой молекулярной массой (HMW) для технологий долгого секвенирования (CLR и ONT) и оптического картирования (Бионано). Поэтому были получены свежезамороженные образцы различных тканей (дополнительная таблица 8). Все образцы были получены в соответствии с утвержденными протоколами соответствующих комитетов по уходу и использованию животных или разрешениями, полученными соответствующими лицами и учреждениями, перечисленными в дополнительной таблице 8.Дополнительная информация об образцах находится на соответствующих страницах BioSample (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample; инвентарные номера в дополнительной таблице 8). Все протестированные типы тканей дали достаточное количество и качество ДНК для секвенирования и сборки, но мы обнаружили, что кровь лучше всего подходит для видов, у которых есть ядра эритроцитов (то есть птиц и рептилий), а селезенка или культивированные клетки лучше всего подходят для млекопитающих. , по состоянию на сегодняшний день. Анализ различных типов тканей будет представлен в другом месте (в процессе подготовки).

Выделение высокомолекулярной ДНК

Выделение ДНК из агарозной пробки

Для тканей ДНК HMW экстрагировали с использованием протокола выделения ДНК из волокнистой ткани Bionano (каталожный номер RE-013-10; номер документа 30071), в соответствии с рекомендациями производителя. Всего 25–30 мг фиксировали в 2% формальдегиде и гомогенизировали с помощью Qiagen TissueRuptor или ручного разрушения тканей. Для ядерной крови использовали 27–54 мкл с адаптированным протоколом (Bionano, личное сообщение) набора Bionano Prep Blood and Cell Culture DNA Isolation Kit (кат.РЭ-130-10). Лизаты заключали в агарозные пробки и обрабатывали протеиназой К и РНКазой А. Затем пробки очищали капельным диализом с 1 × ТЕ. Качество ДНК оценивали с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) (Pippin Pulse, SAGE Science, Беверли, Массачусетс) или прибора Femto Pulse (Agilent). PFGE показал, что мы выделили ДНК сверхвысокой молекулярной массы от ~ 100 до ~ 500 т.п.н.

Экстракция фенол-хлороформной гДНК

Для некоторых образцов мы выполнили фенол-хлороформную экстракцию для HMW-гДНК.Замороженную ткань измельчали в тонкий порошок пестиком в ступке в жидком азоте. Порошкообразную ткань лизировали в течение ночи при 55 ° C в буфере для лизиса тканей с высоким содержанием соли (400 мМ NaCl, 20 мМ трис-основания (pH 8,0), 30 мМ EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 100 мкг / мл протеиназы K). и порошкообразную ткань легких лизировали в течение ночи в буфере для лизиса Qiagen G2 (каталожный номер 1014636, Qiagen, Hilden, Германия), содержащем 100 мкг / мл протеиназы K, при 55 ° C. РНК удаляли инкубацией в 50 мкг / мл РНКазы A в течение 1 ч при 37 ° C.ГДНК HMW очищали двумя промывками смесью фенол-хлороформ-ИУК, уравновешенной до pH 8,0, с последующими двумя промываниями смесью хлороформ-ИУК и осаждали ледяным 100% этанолом. Нитевидную гДНК HMW либо наматывали с помощью пастушьих крючков, либо собирали центрифугированием. ГДНК HMW дважды промывали 70% этанолом, сушили в течение 20 мин при комнатной температуре и элюировали ТЕ. Для образца гДНК мышцы летучего цихлиды, используемого для библиотек PacBio CLR и 10XG, гликоген осаждали добавлением 1/10 (об. / Об.) 0,3 М ацетата натрия, pH 6.0 к экстрагированной геномной ДНК, тщательно перемешивая и центрифугируя при комнатной температуре 10,000 г . PFGE выявил, что длина молекулы ДНК составляет от 50 до 300 т.п.н. — часто меньше по размеру, чем полученная с помощью агарозной пробки, но достаточна для долгосрочного секвенирования CLR и связанных типов данных чтения.

Другое

Мы также использовали набор ДНК Qiagen MagAttract HMW (каталожный номер 67563) и набор KingFisher Cell and Tissue DNA (Thermo Scientific; каталожный номер 97030196) в соответствии с рекомендациями производителей.Эти протоколы дали ДНК HMW в диапазоне от 30 до 50 т.п.н. Набор Genomic Tip (Qiagen) также использовался для тканевой экстракции ДНК HMW.

Библиотеки и секвенирование

Библиотеки PacBio и секвенирование

ДНК, полученная из агарозных пробок, была разрезана до размера фрагмента примерно 40 т.п.н. с помощью устройства MegaRuptor (Diagenode, Бельгия) и фрагментирована с использованием g-пробирок Covaris (520079) или с помощью ножниц. . Большие библиотеки вставок PacBio были подготовлены с помощью набора SMRTbell Template Prep Kit 1.0 ‐ SPv3 (номер 100‐991‐900) или набор для подготовки шаблона SMRTbell Express v1 (номер 101‐357‐000). Библиотеки были выбраны по размеру от 12 до 25 т.п.н. с использованием Sage BluePippin (Sage Science, США) в зависимости от качества ДНК и метода экстракции. Эти библиотеки секвенировали на инструментах RSII или Sequel I, по крайней мере, с 60-кратным охватом для каждого вида с использованием набора для связывания Sequel и планшетов для секвенирования версий 2.0 и 2.1 с 10-часовым киносеансом (дополнительная таблица 9).

10X Chromium библиотеки и секвенирование

Нефрагментированная HMW ДНК из агарозных пробок была использована для создания связанных библиотек чтения на платформе 10X Genomics Chromium (Genome Library Kit и Gel Bead Kit v2 PN-120258, Genome Chip Kit v2 PN-120257, i7 Multiplex Kit PN-120262) в соответствии с рекомендациями производителя.Мы секвенировали 10-кратные библиотеки при ~ 60-кратном покрытии для каждого вида на дорожке PE Illumina NovaSeq S4 длиной 150 п.н.

Библиотеки Bionano и визуализация оптических карт

Нефрагментированная ультра-HMW ДНК из агарозных пробок была помечена с использованием либо двух разных никелирующих ферментов (BspQI и BssSI), либо фермента прямого мечения (DLE1) в соответствии с NLRS Bionano Prep Labeling (номер документа 30024). ) и DLS соответственно (номер документа 30206). Затем меченые образцы отображали на приборе Bionano Irys или Bionano Saphyr.Для всех видов мы стремились обеспечить как минимум 100-кратное покрытие на этикетке (дополнительная таблица 9).

Библиотеки Hi-C и секвенирование

Библиотеки взаимодействия хроматина (Hi-C) были созданы с использованием библиотек Arima Genomics, Dovetail Genomics или Phase на мышцах, крови или других тканях с перекрестным связыванием in vivo (дополнительная таблица 9) и секвенированы на инструментах Illumina. Препараты Arima-HiC были выполнены компанией Arima Genomics (https://arimagenomics.com/) с использованием набора Arima-HiC, в котором используются два фермента (P / N: A510008).Полученную проксимально лигированную ДНК Arima-HiC затем разрезали, отбирали по размеру около 200-600 п.н. с использованием гранул SPRI и обогащали биотин-меченной близкослигированной ДНК с использованием гранул стрептавидина. Из этих фрагментов были созданы библиотеки, совместимые с Illumina, с использованием набора KAPA Hyper Prep (P / N: KK8504). Полученные библиотеки амплифицировали с помощью ПЦР и очищали с помощью гранул SPRI. Качество конечных библиотек проверяли с помощью кПЦР и биоанализатора, а затем секвенировали на Illumina HiSeq X при ~ 60-кратном охвате в соответствии с протоколами производителя.Препараты «Ласточкин хвост-HiC» были выполнены компанией «Ласточкин хвост» с использованием метода бесконтактного лигирования с одним ферментом (DpnII). Библиотеки Phase-HiC были созданы Phase Genomics с использованием одноферментной реакции Proximo Hi-C Library.

Контроль качества

Перед выполнением какой-либо сборки все геномные данные всех типов данных из каждого образца были использованы для проверки библиотек с потенциальными выбросами, запусков выпадающих последовательностей или случайного загрязнения Mash ⁷³ путем измерения сходства последовательностей (дополнительный рис. .4). При запуске Mash мы использовали 21-мерную модель для создания эскизов с размером эскиза 10 000 и сравнивали между каждым циклом секвенирования, а затем оценивали различия между наборами секвенирования.

Оценка размера генома, содержания повторов и гетерозиготности

Эти оценки были сделаны с использованием методов на основе k -меров, примененных к коротким считываниям Illumina, полученным из связанных библиотек секвенирования 10XG. После обрезки штрих-кодов во время предварительной обработки scaff10x ⁷⁴ канонические 31-мерные числа были собраны с использованием Meryl ²³.С полученной 31-мерной гистограммой GenomeScope ⁷¹ использовали для оценки длины гаплоидного генома, содержания повторов и гетерозиготности. Данные считывания, связанные с тернистым коньком, не прошли контроль качества, что, как мы подозреваем, было связано с низкой сложностью последовательностей из-за высокого содержания повторов (54,1%) в геноме; Таким образом, k -меров были собраны позже из считываний полногеномного секвенирования Illumina. Размер генома и содержание повторов канальной собачки были оценены с помощью альтернативного метода, который рассматривает режим перекрытия длинного чтения и WindowMasker ⁷⁵, поскольку предполагаемый размер генома из GenomeScope почти вдвое превышал известный размер гаплоидного генома (1 .29 Гб против 0,6 Гб) и повторяющееся содержание (28,0% против 58,0%) по причинам, связанным либо с качеством данных 10X, либо с различиями видов.

Сравнительный анализ этапов сборки с помощью колибри Анны

Для разработки стандартного конвейера VGP мы сравнили различные строительные леса, инструменты для заполнения зазоров и полировки. Если не указано иное, использовались параметры по умолчанию. Подробные версии программного обеспечения перечислены в дополнительной таблице 2.

Contigging and scaffolding

FALCON ⁷⁶ и FALCON-Unzip ¹⁷ (smrtanalysis 3.0.0) были использованы для генерации контигов, использующих CLR. Canu ⁷⁷ 1.5 + 67 был использован для создания комбинированной сборки PacBio CLR и Oxford Nanopore ONT. Для тестирования скаффолдинга со связанными чтениями мы использовали scaff10x ⁷⁴ 2.0. Для связанной сборки, доступной только для чтения, использовалась Supernova 2 ⁷⁸. Для оптических карт в программе Bionano Solve v3.2.1 использовались гибридные каркасы с двумя ферментами, первоначально с использованием BspQI и BssSI, а также DLE1 позже, когда была разработана технология. Для тестирования Hi-C в строительных лесах, Salsa 2.2 ⁷⁹ был использован для результатов моделирования на рис. 1a, с чтениями Hi-C, сгенерированными из Arima Genomics. Дополнительные сравнения библиотек Hi-C были выполнены с использованием сборок, предоставленных Dovetail Genomics и Phase Genomics (дополнительная таблица 3). Мы использовали Hi-C от Arima Genomics, поскольку он имел наименьшее количество дубликатов ПЦР и лучший охват для коротких и длительных взаимодействий во время сравнения (дополнительный рисунок 1). Статистика сборки HiRise, Proximo HiC, 3D-DNA ⁸⁰ и Arima Hi-C доступна в дополнительной таблице 3.Мы пришли к выводу, что все алгоритмы построения лесов Hi-C имеют одинаковую производительность. Мы решили использовать Salsa, поскольку HiRise и Proximo HiC не были открытым доступом, а 3D-ДНК требовала больших вычислительных ресурсов на платформе DNAnexus. Для сборок с коротким чтением, отличных от сборки Supernova и NRGene, для тестирования использовалась сборка GCA_000699085.1 ¹⁶, которая была сгенерирована с помощью парных библиотек Illumina с несколькими сопряженными парами и ассемблера SoapDeNovo ⁸¹. Сборка NRGene была предоставлена компанией DeNovo Magic.

Заполнение пробелов

Мы запускали PBJelly с параметрами support —capturedOnly —spanOnly, чтобы избежать жадного закрытия пробелов без поддержки считывания охвата. Для последовательностей с консервативным заполнением мы сравнили различные параметры в выходном каскаде с —minreads 1 и —minreads 4 в дополнение к отсутствию ограничений. Мы обнаружили, что количество закрытых зазоров было таким же, как количество закрытых зазоров, заполненных стрелкой ⁷⁶ (дополнительная таблица 4), и решили не запускать PBJelly ⁸² для будущих сборок.

Кратковременная полировка

Тестирование полировки Illumina было выполнено с использованием Longranger ⁸³ 2.1.3 и Pilon ⁸⁴ 1.21 с базами —fix, локальная опция (дополнительная таблица 5). Позже, для конвейера VGP, мы использовали FreeBayes ⁸⁵, поскольку Pilon ⁸⁴ нельзя было масштабировать с вычислительной точки зрения для больших геномов с обновленным Longranger 2.2.2.

Оценка точности базового уровня

Точность базового уровня была измерена с использованием подхода, основанного на картировании, а затем с использованием подхода k , ориентированного на людей ²³.Чтобы определить количество раундов для полировки, мы использовали парные чтения Illumina с колибри ¹⁶.

Ошибочные и пропущенные присоединения

Курируемая сборка колибри была сопоставлена с целевыми сборками с помощью MashMap2 ⁸⁶ с —filter_mode one-to-one —pi 95 с использованием сегментов 5 kb (-s 5000) для CLR сборки и 1 kb (-s 1000) для сборок SR для компенсации более коротких размеров контигов, поскольку контиги, меньшие размера сегмента, будут исключены из выравнивания.Количество ошибочных и пропущенных соединений было определено с помощью файла assembly_comparison.pl, который использовался в разделе «Курирование» ниже (Дополнительные методы, дополнительный рисунок 5).

Стандартный конвейер сборки генома VGP от 1,0 до 1,6

Все 17 геномов были собраны с помощью конвейера VGP (расширенные данные, рис. 2a) для эталонных целей, при этом некоторые из них не подвергались обработке. С помощью конвейера VGP были сгенерированы бледные копьеносые летучие мыши, большие подковоносы, канадская рысь, утконос, самец и самка зебрового зяблика, какапо, колибри Анны, терновая черепаха Гуда, летучая цихлида и тупоносая морская рыба-рыба.0–1,6 и курируется для отправки в публичные архивы NCBI и EBI. Кураторские и представленные сборки двухрядного слепня, зигзагообразного угря, морского окуня, канальной собачки, восточного хэппи и тернистого ската были созданы с использованием аналогичного процесса, разработанного параллельно (дополнительное примечание 2). Были созданы две представленные кураторские версии самки зебрового вьюрка: одна с использованием стандартного конвейера VGP, а другая — с использованием конвейера VGP trio, чтобы другие могли провести сравнительный анализ.

Contigging

Для данных PacBio контиги были сгенерированы из подпотоков с использованием FALCON ⁷⁶ и FALCON-Unzip ¹⁷ с одним раундом полировки Arrow (smrtanalysis 5.1.0.26412). Использовалась минимальная длина чтения 2 кб или порог, при котором считывания длиннее порогового значения, включая 50-кратное покрытие, в зависимости от того, что больше. Для расчета охвата чтения мы использовали предполагаемый размер генома из http://www.genomesize.com/, если он доступен, или из литературы (дополнительная таблица 11), ожидая секвенирования 10XG для оценки размера генома с использованием k -меров. FALCON и FALCON-Unzip запускались с параметрами по умолчанию, за исключением вычисления перекрытий. Необработанные перекрытия при чтении вычислялись с параметрами DALIGNER -k14 -e0.75 -s100 -l2500 -h340 -w8, чтобы лучше отразить более высокую частоту ошибок в ранних сиквелах PacBio I и II. Перекрытия Pread (предварительно собранного чтения) были рассчитаны с параметрами DALIGNER -k24 -e.90 -s100 -l1000 -h600, предназначенными для коллапса гаплотипов для этапа FALCON, чтобы лучше распаковать геномы с высокой степенью гетерозиготности. FALCON-Unzip выводит как псевдогаплотип, так и набор альтернативных гаплотигов, которые представляют вторичные аллели. Мы называем эти выходы первичным набором контигов (c1) и альтернативным набором контигов (c2).

Удаление ложных дупликаций

Гетеротипные ложные дупликации произошли, несмотря на установку параметров FALCON ⁷⁶ для устранения расхождения гаплотипов до 10%. FALCON-Unzip ¹⁷ также неправильно сохранил некоторые вторичные аллели в первичном наборе контигов, которые выглядели как ложные дупликации. Чтобы уменьшить эти ложные дублирования, мы запустили Purge_Haplotigs ¹³, сначала во время курирования (конвейер VGP v1.0), а затем позже после формирования контигов (конвейер VGP v1.5).Чтобы сделать первое, Purge_Haplotigs запускали на первичных контигах (c1), и идентифицированные гаплотиги были сопоставлены с первичной сборкой каркаса с помощью MashMap2 ⁸⁶ для удаления. В последнем случае идентифицированные гаплотиги были перемещены из первичных контигов (c1) в альтернативный набор гаплотигов (p2). Остальные первичные контиги были обозначены как p1; p2 в сочетании с c2 обозначается как q2. Позже, в конвейере VGP v1.6, мы заменили Purge_Haplotigs на Purge_Dups ¹⁴, новую программу, разработанную несколькими авторами в ответ на то, что Purge_Haplotigs не удаляет частичное ложное дублирование на границах контигов.Очистка также удаляет излишние контиги с низким покрытием (мусор) и высоким покрытием (повторы). Чтобы рассчитать наличие и общий успех удаления ложных дупликаций, мы использовали подход с k -мером (дополнительные методы, дополнительный рис. 6).

Каркас со связанными чтениями 10XG

Связанные чтения 10X Genomics были выровнены с первичными контигами (p1), и матрица смежности была вычислена из штрих-кодов с использованием scaff10x ⁷⁴ v2.0–2.1. Выполнено два раунда возведения лесов.Первый цикл был запущен с параметрами -matrix 2000 -reads 12 -link 10, а второй этап — с параметрами -matrix 2000 -reads 8 -link 10. Между соединенными контигами был вставлен промежуток в 100 bp (обозначенный буквами «N»). Полученный первичный набор каркасов был назван s1.

Строительные леса с оптическими картами Bionano

cmaps Bionano были сгенерированы с использованием конвейера Bionano в режиме негаплотипной сборки и использованы для дальнейшего каркаса сборки s1 с помощью Bionano Solve v3.2.1 ⁸⁷.Мы начали с одноферментной «ник-карты» (BspQI), за которой последовала «ник-карта» с двумя ферментами (BspQI и BssSI), а затем с подходом без «никелирования» с одним ферментом DLE-1, когда стали доступны более поздние типы данных (дополнительная информация Таблица 9). Промежутки в каркасе были рассчитаны в соответствии с оценкой программного обеспечения. Полученный набор каркасов был назван s2.

Каркасы с Hi-C чтениями

Hi-C чтения были выровнены с каркасами s2 с помощью конвейера картирования Arima Genomics ⁸⁸. Вкратце, оба конца пары чтения были сопоставлены независимо с помощью BWA-MEM ⁸⁹ с параметром -B8 и отфильтрованы, когда качество сопоставления было <10.Химерные чтения, содержащие сайт рестрикционного фермента, отсекали от рестрикционного сайта и далее, оставляя только 5'-конец. Затем отфильтрованные сопоставления с одним считыванием были повторно объединены как сопоставления с парным считыванием. Обработанные выравнивания затем использовали для построения каркаса с помощью Salsa2 ⁷⁹, который анализирует нормализованную частоту взаимодействий Hi-C между всеми парами концов контигов, чтобы определить вероятный порядок и ориентацию каждого из них. Мы использовали параметры -m yes -i 5 -p yes, чтобы позволить Salsa2 разбивать потенциально неправильно собранные контиги и выполнять пять итераций каркаса.После получения отзывов от курирования были разработаны более поздние версии сальсы, которые более консервативно определяют количество итераций (v2.1) и активно ломаются при неправильной сборке (v2.2) и работают для канадской рыси, черепахи Гуда и двухъярусный цецилион. Рестрикционные ферменты, используемые для создания каждой библиотеки, были указаны с использованием параметров -e GATC, GANTC для Arima и -e GATC для данных Dovetail и Phase Genomics Hi-C. Полученная сборка строительных лесов Hi-C была названа s3.

Полировка консенсуса

Чтобы отполировать основания в обоих гаплотипах с минимальным смещением выравнивания, мы объединили альтернативный набор гаплотигов (c2 в v1.0 или q2 в v1.5–1.6) в каркасный первичный набор (s3) и собранный митохондриальный геном (mitoVGP в v1.6). Затем мы выполнили еще один раунд полировки с помощью Arrow (smrtanalysis 5.1.0.26412) с использованием чтения PacBio CLR, согласовав с pbalign —minAccuracy = 0,75 —minLength = 50 —minAnchorSize = 12 —maxDivergence = 30 –concordant —algorithm = blasr —algorithmOptions = — useQuality —maxHits = 1 —hitPolicy = random —seed = 1 и полировка консенсуса с помощью variantCaller —skipUnrecognizedContigs haploid -x 5 -q 20 -X120 –v —algorithm = arrow.Хотя этот раунд полировки привел к более высокому QV для всех рассмотренных здесь геномов, мы заметили, что он был особенно чувствителен к параметру отсечения покрытия (-x). Это связано с тем, что Arrow генерирует консенсус de novo из сопоставленных операций чтения без явного учета эталонной последовательности. Позже мы обнаружили, что второй этап полировки Arrow иногда снижал точность QV для некоторых видов. После расследования эта проблема была обнаружена до опции -x 5, которая требует не менее 5 чтений для вызова консенсуса.Такие низкие минимальные требования могут привести к неравномерной полировке в областях с низким покрытием. Чтобы избежать такого поведения, мы предлагаем увеличить -x близко к охвату половинной последовательности (например, 30 ×, когда для сборки использовалось 60 ×) и проверить QV перед тем, как двигаться дальше.

Для геномов с объединенным размером сборки более 4 Гб мы использовали Minimap2 ⁹⁰ с параметрами -ax map-pb вместо Blasr ⁹¹, чтобы преодолеть ограничения размера ссылочного индекса.

Были выполнены еще два раунда полировки пар оснований со связанными считываниями.Считывания были выровнены с помощью Longranger align 2.2.2, который включает Lauriat для выравнивания с учетом штрих-кода ⁸³. Из сопоставлений гомозиготные несовпадения (варианты) были вызваны с помощью FreeBayes ⁸³ v1.2.0 с использованием параметров по умолчанию. Консенсус был вызван консенсусом bcftools ⁹² с -i’QUAL> 1 && (GT = ’’ AA ’’ || GT = ‘’ Aa ’’) ’-Hla.

VGP Trio Pipeline v1.0 – v1.6

Конвейер trio спроектирован аналогично стандартному конвейеру, за исключением использования родительских данных (расширенные данные рис.3б). Когда доступны родительские геномы, показания CLR ребенка объединяются с материнскими и отцовскими гаплотипами и собираются отдельно как контиги, специфичные для гаплотипа (гаплотиги), с использованием TrioCanu ²⁰. Вкратце, родительский специфический маркер k -меров собирали с использованием Meryl ²³ из родительских считываний Illumina WGS родителей. Эти маркеры были отфильтрованы и использованы для сортировки чтения CLR ребенка. Гаплотип был назначен с учетом наблюдаемых маркеров, нормализованных по общему количеству маркеров в каждом гаплотипе.Последующие этапы очистки, сборки и полировки были аналогичным образом обновлены с использованием Purge_Dups ¹⁴ (v1.6). Мы расширили биннинг на связанные чтения и чтения Hi-C, исключив пары чтения, которые имели какой-либо родительский маркер. Бинированные считывания Hi-C использовали для каркаса его сборки гаплотипа и полировали объединенными связанными считываниями из наблюдения переключения гаплотипов с использованием стандартного подхода полировки. Во время курирования в качестве репрезентативного гаплотипа была выбрана одна из сборок гаплотипов с более высоким QV и / или смежностью.Гетерогаметная половая хромосома из невыбранного гаплотипа была добавлена в репрезентативную сборку. Однако при изучении нескольких трио мы обнаружили, что в регионах с низким расхождением между общими родительскими гомогаметными половыми хромосомами (то есть X или Z) небольшая часть данных CLR потомков была ошибочно отнесена к неправильному гаплотипу. Это неправильное выравнивание привело к дублированию сборки X или Z потомства с низким охватом в отцовском (для млекопитающих) или материнском (для птиц) гаплотипе, соответственно, что потребовало удаления во время культивирования.Мы работаем над методами повышения точности биннинга для решения этой проблемы в будущем.

В частности, для самки зебры-зяблика контиги были сгенерированы до того, как объединение было автоматизировано в ассемблере Canu как TrioCanu1.7, и поэтому был применен процесс объединения вручную, как описано в исходной статье Trio-binning ²⁰ (Дополнительные методы ). Контиги были собраны для каждого гаплотипа с использованием разделенных чтений, за исключением неклассифицированных чтений. Контиги были отполированы двумя раундами полировки Arrow с использованием разбитых считываний и построены в соответствии с v1.0 трубопровод без продувки. Были применены дополнительные раунды строительных лесов с Bionano (s4) и Hi-C. Каркасы были переименованы в соответствии с первичной сборкой каркаса одного и того же человека (s5), при этом половые хромосомы сгруппированы как Z в отцовской сборке и W в материнской сборке после синтении с Z-хромосомой из курируемой сборки VGP самца зебрового зяблика. Были применены два раунда полировки SR с использованием связанных чтений путем картирования на обоих гаплотипах. После того, как были обнаружены переключатели гаплотипов, были применены дополнительные раунды полировки с использованием бинированных связанных чтений (дополнительные методы).

Сборка митохондриального генома

Подобно другим недавним методам ^93,94, мы разработали конвейер сборки МТ на основе контрольных образцов. Считывания MT в необработанных данных CLR были идентифицированы путем сопоставления всего набора считываний с существующей эталонной последовательностью конкретных видов или близкородственных видов с помощью Blasr. Отфильтрованные CLR мтДНК были собраны в один контиг с помощью Canu v1.8, отполированы с помощью Arrow с помощью CLR, а затем FreeBayes v1.0.2 вместе с bcftools v1.9 с использованием коротких считываний данных 10XG (расширенные данные, рис.3в). Перекрывающиеся последовательности на концах контига были обрезаны, а оставшаяся последовательность контигов сделана циркуляризованной. Конвейер mitoVGP доступен по адресу https://github.com/VGP/vgp-assembly/tree/master/mitoVGP. Более подробное описание протокола сборки конвейера и новых открытий из сборок MT опубликовано в другом месте ³³.

Curation

Конвейер сборки генома VGP производит высококачественные сборки, однако до сих пор ни один автоматизированный метод не избавлен от ошибок, особенно на этапах создания каркасов.Чтобы свести к минимуму влияние оставшихся алгоритмических недостатков, мы подвергли все сборки тщательной ручной обработке. Все данные, полученные для вида в этом исследовании, и другие общедоступные данные (например, генетические карты, наборы генов и сборки генома одного и того же или близкородственных видов) были сопоставлены, согласованы с первичной сборкой и проанализированы в gEVAL ⁹⁵ ( https://vgp-geval.sanger.ac.uk/index.html), визуализируя несоответствия в браузере функций и списках проблем. Параллельно данные Hi-C были сопоставлены с первичной сборкой и визуализированы с помощью Juicebox ⁹⁶ и / или HiGlass ⁹⁷.С помощью этих данных кураторы генома определили неправильные соединения, пропущенные соединения и другие аномалии и соответствующим образом исправили первичную сборку. Никаких изменений не было сделано без недвусмысленных свидетельств имеющихся типов данных; например, предлагаемое соединение Hi-C не будет выполнено, если оно не поддерживается картами BioNano, данными длительного чтения или выравниванием генов. При секвенировании гетерогаметного пола мы определили половые хромосомы на основе половинного покрытия, выравнивания гомологии с половыми хромосомами у других видов и наличия генов, специфичных для половых хромосом.

Удаление загрязнений

Для выявления потенциальных загрязнителей в сгенерированных сборках была использована последовательность поисков.

1) Поиск megaBLAST ⁹⁸ в базе данных распространенных загрязнителей (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/kitts/contam_in_euks.fa.gz), требующий e ≤ 1 × 10 ^-4, сообщают о совпадениях с ≥98% идентичности последовательностей и длиной совпадения 50–99 п.н., ≥94% и длиной совпадения 100–199 п.н., или ≥90% и длиной совпадения 200 п.н. или выше.

2) Векскрин (https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) поиск по базе данных последовательностей адаптеров (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/kitts/adaptors_for_screening_euks.fa)

3) После soft- маскирование повторов с использованием Windowmasker ⁷⁵, поиск megaBLAST по сборкам хромосомного уровня из RefSeq, требующий e ≤ 1 × 10 ⁻⁴, оценка соответствия ≥100 и идентичность последовательности ≥98%; области, соответствующие высококонсервативным рДНК, игнорировались.

Ручная проверка результатов была необходима, чтобы отличить контаминацию от консервации и / или горизонтального переноса генов.Последовательности адаптеров были замаскированы; другие последовательности загрязнителей были удалены. Сборки также проверялись на наличие пробегов N на концах каркасов, созданных как артефакты итеративного процесса построения каркасов, и при обнаружении они были обрезаны.

Геномы органелл

Они были обнаружены с помощью поиска megaBLAST в базе данных известных геномов органелл, требующих e ≤ 1 × 10 ⁻⁴, идентичности последовательностей ≥90% и длины совпадения ≥500; базы данных доступны по адресу ftp: // ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/mito.nt.gz и ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid/*genomic.fna.gz. Предполагалось, что только каркасы, полностью состоящие из последовательностей органелл, являются геномами органелл и заменены геномом из отдельного конвейера сборки органелл. Соответствующие органеллы, встроенные в ядерные последовательности, которые оказались NuMT, сохранялись.

Удаление ложной дупликации

Сохраненные ложные дупликации были идентифицированы с помощью Purge_Haplotigs ¹³ прогона либо после возведения лесов и полировки (колибри Анны, какапо, самец зебрового зяблика, самка зебрового зяблика, утконос, бледная летучая мышь с копьевидным носом) и большая подковообразная летучая мышь или на c1 до строительных лесов (двухрядный цецилий, летучая цихлида, канадская рысь и черепаха с шипами Гуда).Последующее ручное курирование выявило дополнительные гаплотипические дупликации для перечисленных сборок, а также тех, которые не обрабатывались Purge_Haplotigs (восточный хэппи, альпинистский окунь, зигзагообразный угорь). Использованные доказательства включали охват считыванием, самосравнение последовательностей, выравнивание транскриптов, выравнивание карты Bionano и двухмерные карты Hi-C, которые подтверждали избыточную природу одного аллеля. Выявленные дупликации гаплотипов были перемещены из первичной сборки в альтернативную.

Присвоение хромосом

Для аннотирования каркаса как хромосомы мы использовали данные Hi-C, а также данные о генетическом сцеплении или картирование кариотипа FISH, если оно доступно.Для доказательств Hi-C мы рассматривали каркас как полную хромосому (хотя и с пробелами), когда на графиках Juicebox или HiGlass для этого каркаса была четкая непрерывная диагональ и не было других больших каркасов, которые можно было бы присоединить к тому же каркасу; если он присутствует и однозначное соединение невозможно, мы назвали его нелокализованным каркасом для этой хромосомы. Когда мы не могли найти доказательств наличия полной хромосомы, мы сохранили номер каркаса для его названия. Мы назвали все подтвержденные доказательствами скаффолды хромосомами с наименьшим разрешением Hi-C-боксов, допускаемым этими характеристиками.Когда существовала установленная хромосомная терминология для данного вида или набора видов, мы используем установленную терминологию, за исключением случаев, когда наши новые сборки выявляли ошибки в старой сборке, такие как слияние каркаса / хромосомы, деления, перестройки и нехромосомных названий. Для видов без установленной хромосомной терминологии мы назвали каркасы номерами хромосом 1, 2, 3… в порядке убывания размера каркаса. Для половых хромосом мы использовали буквы X и Y для млекопитающих и Z и W для птиц.

Использование сравнительной геномики для оценки структуры сборки

В случаях, когда высококачественный геном на уровне хромосом был доступен для близкородственных видов, был проведен сравнительный анализ генома. Отшлифованная первичная сборка (t3.p) была сопоставлена со связанным геномом с помощью MashMap2 ⁸⁶ с —pi 75 -s 300000. Количество хромосомных различий было определено с помощью специального сценария, доступного на https://github.com/ jdamas13 / assembly_comparison. Это привело к идентификации от ~ 60 до ~ 450 регионов для каждой сборки генома, фланкирующих предполагаемые неправильные сборки или клон-специфические перестройки генома.Чтобы определить, какие из них были настоящими неправильными сборками, выявленные несоответствия были переданы группе курирования для ручной проверки (см. Выше).

Чтобы идентифицировать любые возможные оставшиеся неправильные соединения, каждую курируемую сборку птиц и млекопитающих сравнивали с геномами зебрового зяблика (taeGut2) или человека (hg38) соответственно. Попарное выравнивание между каждой из сборок VGP и эталоном клады было произведено с помощью LastZ ⁹⁹ (версия 1.04) с использованием следующих параметров: C = 0 E = 30 H = 2000 K = 3000 L = 2200 O = 400.Попарные выравнивания были преобразованы в форматы UCSC ‘chain’ и ‘net’ с помощью axtChain (параметры: -minScore = 1000 -verbose = 0 -linearGap = medium), за которым следовали chainAntiRepeat, chainSort, chainPreNet, chainNet и netSyntenic, все с параметрами по умолчанию. ¹⁰⁰. Блоки парной синтении были определены с использованием maf2synteny ¹⁰¹ с разрешениями 100, 300 и 500 кб. Области эволюционных точек останова были обнаружены и классифицированы с использованием специального статистического подхода ¹⁰².Этот анализ идентифицировал от 2 до 90 геномных областей на сборку, которые могли фланкировать неправильные сборки, хромосомные перестройки, специфичные для клонов, или референс-специфические хромосомные перестройки (116 у человека и 26 у зебрового зяблика). Для определения основной причины каждого из отмеченных регионов потребуется дополнительная проверка. Все сопоставления доступны для визуализации в браузере сравнительных хромосом Evolution Highway (http://eh-demo.